朱雄偉,翟莉莉,張楠,蘇騰甲

(武漢工程大學化工與制藥學院,綠色化工過程省部共建教育部重點實驗室,湖北 武漢 430074)

靈菌紅素(prodigiosins,PG)是一類天然紅色素的總稱,是一些放線菌、沙雷菌及其他細菌的代謝產(chǎn)物.研究發(fā)現(xiàn),靈菌紅素具有抗細菌、抗真菌、抗瘧疾、免疫抑制和抗腫瘤等生物活性,因此受到人們的廣泛關注[1].長期以來,靈菌紅素的研究主要側重于其化學合成途徑的探索及其潛在的臨床應用,而對靈菌紅素的生產(chǎn)研究較少.隨著生物操作技術的發(fā)展和對靈菌紅素的深入研究,人們將更加清晰地認識靈菌紅素的產(chǎn)生和作用機制,大量生產(chǎn)制備靈菌紅素,用于替代在癌癥及免疫治療中對人體有害作用的化學藥物,造福于人類[2-3].本研究從糖化車間分離一種菌株,對其代謝產(chǎn)物進行分析,發(fā)現(xiàn)菌株可產(chǎn)靈菌紅素,并對菌株形態(tài)和菌落特征、生理生化特性、全細胞脂肪酸組分進行研究,并通過測定其16S rRNA基因序列的方法來鑒定此菌株[4].

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品 由湖北省黃石市興華生化有限公司糖化車間提供.

1.1.2 試劑與儀器 瓊脂糖;溴化乙錠;上樣緩沖液;AE電泳緩沖液;特異引物;PCR Buffer;dNTPmix;Taq酶;AxyPrep 基因組DNA提取試劑盒;AxyPrep DNA 凝膠回收試劑盒;牛肉膏;蛋白胨;檸檬酸三鈉;NaCl;瓊脂粉;可溶性淀粉;CaCl2;PCR儀;電泳儀;電熱恒溫鼓風干燥箱;高壓蒸汽滅菌鍋;恒溫培養(yǎng)箱;高速離心機;智能傅立葉紅外光譜儀Nexus470 FT-IR;美國MIDI的全自動鑒定系統(tǒng).

1.1.3 培養(yǎng)基 優(yōu)化培養(yǎng)基:蛋白胨質量分數(shù)10%,牛肉膏質量分數(shù)5%, 瓊脂質量分數(shù) 2%(固), CaCl2質量分數(shù)0.156%,調(diào)pH至5.0～6.5;基礎培養(yǎng)基:葡萄糖質量分數(shù)2%,NaCl質量分數(shù)0.5%,瓊脂質量分數(shù) 2%(固).

1.2 方法

1.2.1 篩選方法

(1)初篩培養(yǎng).制備初篩菌懸液:稱取土壤樣品1 g.接種于高壓滅菌的基礎培養(yǎng)基中,30～37 ℃連續(xù)培養(yǎng)30 d進行富集,得初篩菌懸液;取初篩菌懸液20 μL涂布于固體基礎培養(yǎng)基;在初篩平板上挑取不同形態(tài)的單菌落在液體優(yōu)化培養(yǎng)基中擴大培養(yǎng),并進一步進行涂布分離,經(jīng)多次純化、分離,最后得到不同菌落形態(tài)的純平板;挑取純平板的單菌落于基礎培養(yǎng)基中,30 ℃恒溫培養(yǎng)過夜,得分離菌懸液[5].

(2)復篩培養(yǎng).制備復篩菌懸液,在一定濃度氯化銨基礎培養(yǎng)基內(nèi),加入初篩分離菌的分離菌懸液50 μL,30 ℃恒溫振搖5～7 d,得復篩菌懸液;取復篩菌懸液20 μL涂于固體優(yōu)化培養(yǎng)基,30 ℃恒溫培養(yǎng)1～2 d,觀察并記錄細菌生長情況以及菌落形態(tài);然后挑取單菌落在優(yōu)化培養(yǎng)基中逐級加入一定梯次濃度的檸檬酸三鈉,分離得到純的此菌株.

1.2.2 代謝產(chǎn)物紅色素的提取與分離[6-7]發(fā)酵液離心后得到的菌體經(jīng)過酸性甲醇萃取,萃取液經(jīng)濃縮去溶劑,用乙酸乙酯溶解,低溫靜置,沉淀后得到的混合物用硅膠柱層析(氯仿和乙酸乙酯洗脫),最后去溶劑得到紅色素粗產(chǎn)品,再利用薄層色譜和柱色譜法對其進行再分,得到紅色素純品.

1.2.3 代謝產(chǎn)物紅色素紅外分析[8-9]物質紅外光譜的波長位置與吸收譜帶的強度,反映了其分子結構的特點,結構不同的化合物具有不同的振動吸收頻率,由此可鑒定未知物的結構組成、確定其化學基團.紅外條件:采用液膜法, 紅外光譜能量為 40 mW; 波數(shù)范圍為 400～4 000 cm- 1.

1.2.4 菌株全細胞脂肪酸組分分析 采用美國MIDI的全自動鑒定系統(tǒng).

1.2.5 菌株鑒定

(1)提取細菌核DNA(AxyPrep 基因組DNA提取試劑盒).

(2)16S rDNA基因的PCR擴增:PCR擴增引物參照Weisburg等人的方法合成:

P1:正向引物5’AGAGTTTGATCCTGGCTCAG3’.

P2:反向引物5’GGTTACCTTGTTACGACTT3’.

(3)PCR產(chǎn)物的凝膠電泳:將PCR產(chǎn)物以1%瓊脂糖凝膠進行電泳.

(4)PCR產(chǎn)物凝膠回收(DNA 凝膠回收試劑盒).

(5)16S rDNA 測序:PCR測序用正反向引物參照Hiraishi等人方法合成.加入1μL模板DNA (<0.1μg),PCR擴增30個循環(huán)(94 ℃ 1 min,55 ℃ 30 s,72 ℃ 2 min).采用ABI PRI優(yōu)化測序試劑盒中染料終止劑終止反應.然后,在Applied Biosystem 373 A DNA 測序儀上測序.測得的16SrDNA序列采用BLAST軟件與GenBank 數(shù)據(jù)庫比較分析,最終從分子水平上確定該菌的種屬.

2 結果與分析

2.1菌株菌落形態(tài)圖1所示的是產(chǎn)靈菌紅素菌株的菌落形態(tài),菌落呈紅色、不透明、表面光滑、球狀凸起、粘稠狀,紅色菌落周圍是乳白色的菌株.

2.2紅色素紅外光譜分析圖2所示的是紅色素的紅外光譜圖,紅色素的紅外光譜的主要吸收峰的波數(shù)分別為:3 400、2 981、2 843、1 657、1 241、1 032、713 cm-1.

圖1 菌株菌落形態(tài)

圖2 紅色素的紅外光譜圖

圖3 菌株脂肪酸組成和含量色譜圖

2.3全細胞脂肪酸組分分析圖3所示的是菌株ZSG脂肪酸組成和含量色譜圖[12].如圖3可知:經(jīng)MIS微生物系統(tǒng)分析,主要脂肪酸種類和含量為:14∶0 iso 3OH(5.63%),17∶0 cyclo(14.55%)14∶0 3OH/16∶1 iso I(8.46%),18∶1 w7c(12.44%),符合粘質沙雷氏菌的特征.

2.4菌株生理生化特性菌株生理生化特性如表1所示.

表1 菌株生理生化特性

2.516SrDNA序列測定及BLAST結果以細菌的核DNA為模板,以16S rRNA基因的PCR擴增的通用引物為引物,進行PCR擴增,得到長度為1 484 bp的擴增帶(用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測),PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后,測定其全序列.

BLAST結果所示:gb|FJ360759.1|Serratiamarcescensstrain PSB19 16S ribosomal RNA gene, partial sequence Length=1 457 Score = 2 534 bits (1372), Expect = 0.0 Identities = 1 422/1 453 (97%), Gaps = 12/1453 (0%),Strand=Plus/Plus.根據(jù)16S rRNA基因測序BLAST結果,推斷此菌株為粘質沙雷氏菌Serratiamarcescens.

3 結論

本研究從糖化車間分離得到一種產(chǎn)紅色素菌株,該紅色素經(jīng)過紅外光譜分析被證明為靈菌紅素[13-14].通過測定菌株16S rRNA基因序列,并對其生理生化特征進行測定.通過對其16S rRNA基因序列和全細胞脂肪酸組分分析,均表明該菌株為粘質沙雷氏菌.

致謝感謝湖北省黃石市興華生化有限公司對本研究的大力支持.

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