何光志

(貴陽中醫(yī)學(xué)院,中國 貴陽 550002)

長期以來,腫瘤一直是醫(yī)藥界最大的研究課題之一．蛇毒L-氨基酸氧化酶(LAAO)是一種有潛力的抗腫瘤制劑,具有廣闊的臨床應(yīng)用前景．但目前提取竹葉青蛇毒L-氨基酸氧化酶的工業(yè)化生產(chǎn)還不現(xiàn)實(shí)．與此相比,基因工程技術(shù)的發(fā)展使得大規(guī)模制備竹葉青蛇毒L-氨基酸氧化酶成為可能．

本研究通過構(gòu)建竹葉青蛇毒L-氨基酸氧化酶Pet28a(+)-LAAO表達(dá)載體轉(zhuǎn)化表達(dá)菌株BL21(DE3)，進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá),純化蛋白接種荷瘤小鼠,計(jì)算重組蛋白的抑瘤率和延長載瘤小鼠的存活時(shí)間,擬在為開發(fā)利用竹葉青蛇毒提供依據(jù),為進(jìn)一步研制新型的抗腫瘤藥物打基礎(chǔ)．

1 試劑與材料

1.1 試劑

IPTG,Sigma公司產(chǎn)品；裂解液,去污劑(Triton X-100),尿素和Taq酶,捷瑞生物公司產(chǎn)品；BamHⅠ和HindⅢ,MBI公司產(chǎn)品；SDS, TaKaRa公司產(chǎn)品；DNA Marker DL2000, TaqPCR MasterMix, BL21(DE3),大連寶生物公司產(chǎn)品；DNA回收試劑盒,QIAGEN公司產(chǎn)品產(chǎn)品； PCR引物, 由上海生工合成； pMD18-T-ALAg,由本實(shí)驗(yàn)室制備保持；Pet28a(+),Invitrogen產(chǎn)品,其他試劑均為分析純．

1.2 材料

竹葉青蛇毒,采自貴州省思南縣；健康小鼠(4～6周齡、體重18～20 g的雄性清潔級昆系小白鼠)和健康白兔(體重1 500～2 000 g),購自貴陽醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心；鼻咽癌CNE-2Z、人宮頸癌LYA01021和卵巢癌A2780 MSC株,購于中科院細(xì)胞所．

2 方法

2.1 兔抗竹葉青蛇毒LAAO陽性血清的制備

按張明芳等人方法[1]進(jìn)行純化竹葉青蛇毒LAAO, 保存?zhèn)溆?；取一部分竹葉青蛇毒用甲醛脫毒后,加油佐劑(質(zhì)量濃度為0.2 g/L),免疫分為基礎(chǔ)免疫和超免疫,在兔子的背部兩側(cè)肌肉注射(0.1 μg)進(jìn)行基礎(chǔ)免疫,每次間隔3周,在皮下和肌肉、穴位交替進(jìn)行加強(qiáng)免疫,每只兔子1 mg,每次免疫間隔2周．免疫后采用瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)測免疫血清效價(jià),達(dá)到28時(shí)進(jìn)行采血分離血清．

2.2 質(zhì)粒DNA的小量提取

從冰箱取出含pMD18-T-LAAO的DH5α的EP管于冰浴溶解,1 000 r/min離心5 min,加入10 μL 的LB液體培養(yǎng)基,37 ℃200 r/min振蕩培養(yǎng)1 h,涂布于含有氨芐青霉素(Amp,100 mg/L)的LB瓊脂平板上,37 ℃培養(yǎng)12～16 h,挑取菌落加入100 μL 的LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng),離心取沉淀進(jìn)行質(zhì)粒DNA提?。?/p>

2.3 Pet28a(+)-LAAO構(gòu)建和酶切鑒定

pMD18-T-LAAO和Pet28a(+)質(zhì)粒經(jīng)BamHⅠ和HindⅢ分別進(jìn)行雙酶切,回收目的片段進(jìn)行連接并轉(zhuǎn)化DH5α,并將其鋪于含有Amp的LB培養(yǎng)基平板中,挑取單個(gè)菌落加入LB液體培養(yǎng)基中在37℃培養(yǎng)過夜,PCR檢測為陽性菌落，進(jìn)行抽提質(zhì)粒DNA．采用BamHⅠ和HindⅢ進(jìn)行雙酶切鑒定,將雙酶切鑒定正確的菌株送往大連寶生物公司測序．

2.4 重組蛋白誘導(dǎo)表達(dá)及SDS-PAGE

將測序正確的菌株抽提Pet28a(+)-LAAO質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21(DE3),加入100 μL 的LB液體培養(yǎng)基,37 ℃200 r/min培養(yǎng)1 h,涂布于含有Amp的LB瓊脂平板上37 ℃培養(yǎng)12～16 h,挑取單個(gè)菌落進(jìn)行PCR,PCR陽性菌株加入5 mL培養(yǎng)物經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)3 h,同時(shí)設(shè)未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)的菌株作為對照．取誘導(dǎo)和未誘導(dǎo)的細(xì)菌培養(yǎng)物離心后,分別取沉淀和上清液按1∶1的體積比加入2×上樣緩沖液煮沸5 min,瞬間離心．在樣品孔內(nèi)分別加入待檢樣品(10 μL/孔)進(jìn)行電泳,同時(shí)設(shè)標(biāo)準(zhǔn)蛋白Marker,采用考馬斯亮藍(lán)R-250進(jìn)行染色．

2.5 重組蛋白的純化

含有Pet 28a(+)-LAAO的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21(DE3)菌液按體積比1∶100加入LB液體培養(yǎng)基混勻，將混合物的BL21(DE3)接種到新的LB液體培養(yǎng)基中,37 ℃培養(yǎng)至OD550=1.0．IPTG誘導(dǎo)3 h進(jìn)行大量表達(dá),收集誘導(dǎo)表達(dá)菌．純化重組蛋白參照舒雨雁等方法進(jìn)行[2]．

2.6 Western-blot 分析

將分離的竹葉青蛇毒LAAO和純化蛋白進(jìn)行SDS-PAGE,電泳結(jié)束后進(jìn)行轉(zhuǎn)膜和Western-blot分析．用0.01 mol/L PBS洗膜3次,5 min/次(以下同)；加入包被液室溫孵育2 h；棄包被液,洗膜；加入兔抗竹葉青蛇毒陽性血清(按1∶500的體積比稀釋),4 ℃孵育12 h以上；棄一抗,洗膜3次；加入羊抗兔辣根過氧化物酶偶聯(lián)的二抗(1∶8 000體積比稀釋),室溫孵育2 h；棄二抗,用 PBS洗膜4次；加入顯色液(TMB)避光顯色．

2.7 重組蛋白對荷瘤小鼠抑瘤率和生命延長率的影響

2.7.1 建立小鼠鼻咽癌、人宮頸癌和卵巢癌實(shí)體瘤模型 分別取出凍存鼻咽癌CNE-2Z、人宮頸癌LYA01021和卵巢癌A2780 MSC細(xì)胞株復(fù)蘇后進(jìn)行培養(yǎng)．用0.2%臺盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)活細(xì)胞率．當(dāng)活細(xì)胞率≥95%時(shí),調(diào)整細(xì)胞數(shù)為1×106個(gè)/mL,分別于小鼠右腋下注射接種0.2 mL/只,以建立小鼠鼻咽癌、人宮頸癌和卵巢癌實(shí)體瘤模型．同時(shí)用空白對照組用生理鹽水、CTX陽性對照組和竹葉青蛇毒分離LAAO陽性對照組．

2.7.2 重組蛋白對荷瘤小鼠抑瘤率和生命延長率的影響 動(dòng)物隨機(jī)分6組，每組20只.其中3個(gè)組為鼻咽癌CNE-2Z、人宮頸癌LYA01021和卵巢癌A2780 MSC細(xì)胞組,接種癌細(xì)胞24 h后,每組又分為重組蛋白高、中、低劑量3個(gè)小組(100、50和20 μg/g)；另外3個(gè)組分別為PBS陰性、蛇毒中分離LAAO和CTX陽性對照組腹腔注射(0.01 mL/g體重)．所有動(dòng)物每天給藥1次,連續(xù)10 d；停藥第2天每組取10只小鼠脫頸處死,剖取瘤塊進(jìn)行稱重,采用腫瘤抑制率(%)=(對照組平均瘤重-給藥組平均瘤重)/對照組平均瘤重×100公式計(jì)算抑瘤率．每組余下的未處死10只小鼠停藥后觀察小鼠存活天數(shù),計(jì)算小鼠生命延長率．生命延長率(%)=(給藥組平均存活天數(shù)-對照組平均存活天數(shù))/對照組平均存活天數(shù)×100．

M: 2 000 bp Marker; 1: Pet28a(+)-LAAO雙酶切產(chǎn)物.圖1 重組Pet28a(+)-LAAO質(zhì)粒酶切鑒定

2.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

用SPSS軟件進(jìn)行分析,統(tǒng)計(jì)結(jié)果用“x±s”來表示．

3 結(jié)果

3.1 Pet28a(+)ALAg質(zhì)粒的酶切鑒定

將Pet28a(+)-LAAO質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α,挑取單個(gè)菌落提取質(zhì)粒,用BamHⅠ和HindⅢ進(jìn)行雙酶切鑒定,可得到大于2 000 bp的pET32a(+)載體骨架片段和1 700 bp左右的目的基因片段,目的基因片段與預(yù)期1 707 bp大小相符(圖1),表明目的基因片段已連接到Pet28a(+)載體中．

3.2 SDS-PAGE和Western-blot分析

1: 分離竹葉青蛇毒LAAO與兔抗竹葉青蛇毒LAAO陽性血清反應(yīng)； 2:含 Pet28a(+)-LAAO菌落誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物與兔抗竹葉青蛇毒LAAO陽性血清反應(yīng)；3: 含空載體菌株進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物與兔抗竹葉青蛇毒LAAO陽性血清沒有發(fā)生反應(yīng)；4: 人工分離竹葉青蛇毒LAAO經(jīng) SDS-PAGE；5: 蛋白質(zhì) marker；6: 含 Pet28a(+)-LAAO菌落進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)；7: 含空載體菌株進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá).圖2 SDS-PAGE和Western-blotting

將構(gòu)建的Pet28a(+)-LAAO轉(zhuǎn)化E.coliDH5α,挑取陽性克隆進(jìn)行測序,將正確的克隆菌的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到E.coliBL21中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá),取菌液離心取上清,沉淀經(jīng)超聲波破碎后離心,分別經(jīng)SDS-PAGE分析發(fā)現(xiàn)表達(dá)蛋白主要以包涵體表達(dá)．取誘導(dǎo)表達(dá)3 h的菌液進(jìn)行SDS-PAGE,表達(dá)產(chǎn)物相對分子質(zhì)量約為58 000,而含空載體的細(xì)菌經(jīng)誘導(dǎo)后無58 000條帶.將純化后的蛋白進(jìn)行Western-blot分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)含空載體菌表達(dá)產(chǎn)物不能和兔抗竹葉青蛇毒LAAO陽性血清發(fā)生反應(yīng),而含重組載體菌表達(dá)產(chǎn)物能與兔抗陽性血清發(fā)生反應(yīng),結(jié)果如圖2．

3.3 重組蛋白對荷瘤小鼠生命延長率的影響

重組蛋白低、中、高3個(gè)劑量組和CTX陽性對照組均能明顯延長瘤小鼠的存活時(shí)間．統(tǒng)計(jì)分析顯示,重組蛋白低、中、高劑量組荷瘤小鼠生命延長率與陰性對照組相比較均表現(xiàn)為差異極顯著(P<0.01)；相同劑量(20 μg/g體重)的重組蛋白組與蛇毒分離LAAO在抑瘤率沒有顯著差異外,其余重組蛋白(50、100 μg/g體重)組與人工蛇毒分離LAAO組(20 μg/g體重)均存在顯著差異(P<0.01)；各重組蛋白組與CTX陽性對照組比較雖然表現(xiàn)為差異極顯著(P<0.01),但本研究結(jié)果均能揭示重組蛋白可提高荷瘤小鼠生命延長率(表1～3)．

表1 重組蛋白對人鼻咽癌細(xì)胞荷瘤小鼠生命延長率的影響(x±s,n=10)

注:與陰性對照組比較,AP<0.001；與CTX陽性對照比較,BP<0.01；與蛇毒分離LAAO比較,CP<0.01．

表2 重組蛋白對人宮頸癌細(xì)胞荷瘤小鼠生命延長率的影響(x±s,n=10)

注:與陰性對照組比較,AP<0.001；與CTX陽性對照比較,BP<0.01；與蛇毒分離LAAO比較,CP<0.01．

表3 重組蛋白對人卵巢癌細(xì)胞荷瘤小鼠生命延長率的影響(x±s,n=10)

注:與陰性對照組比較,AP<0.001, 與CTX陽性對照比較,BP<0.01； 與蛇毒分離LAAO比較,CP<0.01．

3.4 重組蛋白對荷瘤小鼠抑瘤率的影響

純化蛋白對荷瘤小鼠抑瘤率實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,小鼠灌服重組蛋白后,低、中、高3個(gè)劑量組(20、50、100 μg/g體重,此劑量換算成藥物劑量)對小鼠實(shí)體瘤均有明顯的抑制作用．結(jié)果分析顯示:低、中、高劑量組與陰性對照組比較,差異均極顯著(P<0.01)；相同劑量的重組蛋白組與人工蛇毒分離LAAO(20 μg/g體重)在抑瘤率沒有顯著差異外,其余重組蛋白(50 、100 μg/g體重)組與人工蛇毒分離LAAO組(20 μg/g體重)均存在顯著差異；各重組蛋白組與CTX對照組相比較雖然表現(xiàn)為差異極顯著(P<0.01),但本研究結(jié)果均能揭示重組蛋白可顯著地抑制小鼠實(shí)體瘤的生長(表4～6)．

表4 重組蛋白對人鼻咽癌細(xì)胞荷瘤小鼠抑瘤率的影響(x±s,n=10)

注:與陰性對照組比較,AP<0.01；與CTX陽性對照比較,BP<0.01；與蛇毒分離LAAO比較,CP<0.01．

表5 重組蛋白對人宮頸癌細(xì)胞荷瘤小鼠抑瘤率的影響(x±s,n=10)

注:與陰性對照組比較,AP<0.01；與CTX陽性對照比較,BP<0.01；與蛇毒分離LAAO比較,CP<0.01．

表6 重組蛋白對卵巢癌細(xì)胞荷瘤小鼠抑瘤率的影響(x±s,n=10)

注:與陰性對照組比較,AP<0.001；與CTX陽性對照比較,BP<0.01；與蛇毒分離LAAO比較,CP<0.01．

在本次試驗(yàn)中,筆者觀察和解剖荷瘤小鼠,并通過肉眼觀察重組LAAO組和蛇毒分離LAAO組小鼠，可見小鼠心肌水腫、并有少許的紅細(xì)胞滲出,肝臟壞死、肺出血、充血,肺泡間隔毛細(xì)血管充血、脾臟和腎臟充血壞死等癥狀．陰性對照組的小鼠心、肝、脾、肺和腎重要臟器并無明顯異常．

4 討論

(1)蛇毒L-氨基酸氧化酶廣泛分布于毒蛇的毒液中,其含量高、酶活性強(qiáng)．Suhr等從蛇毒中分離提取出的L-氨基酸氧化酶,能夠誘導(dǎo)鼠淋巴性白血病細(xì)胞L1210 產(chǎn)生凋亡[3]．Torii 等從西部菱背響尾蛇蛇毒中提取出具有LAAO 活性的Apoxin I 蛋白可誘導(dǎo)人早幼粒細(xì)胞白血病細(xì)胞HL260、人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞和人卵巢癌細(xì)胞A2780 及鼠內(nèi)皮細(xì)胞KN23發(fā)生凋亡[4]．Dulce等從蝮蛇蛇毒中提取的LAAO具有誘導(dǎo)HL260 細(xì)胞凋亡的活性[5]．Liu等從江浙蝮蛇蛇毒中分離得到的LAAO,能夠誘導(dǎo)人肺癌上皮細(xì)胞A549 細(xì)胞DNA 發(fā)生片段化[6]．Abe和Ahn等人報(bào)道了蛇毒可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡或壞死[7-8]．黃紅坤等從眼鏡王蛇蛇毒中分離的LAAO能夠誘導(dǎo)人腭部小涎腺腺樣囊性癌細(xì)胞系NACC 細(xì)胞凋亡[9]．

(2)長期以來,腫瘤一直是醫(yī)藥界最大的研究課題之一．蛇毒L-氨基酸氧化酶(LAAO)是一種有潛力的抗腫瘤制劑,具有廣闊的臨床應(yīng)用前景．但目前提取竹葉青蛇毒L-氨基酸氧化酶的工業(yè)化生產(chǎn)還不現(xiàn)實(shí)．與此相比,基因工程技術(shù)的快速發(fā)展使得大規(guī)模制備竹葉青毒L-氨基酸氧化酶成為可能．黃金路等報(bào)道LAAO的細(xì)菌異源表達(dá)系統(tǒng)[10]．Zha等將海兔子來源的LAAO在大腸桿菌中進(jìn)行了第一次異源表達(dá),且表達(dá)量較低[11]．這些不太成功的LAAO異源表達(dá),可能原因有LAAO消耗表達(dá)體系內(nèi)的L-氨基酸而產(chǎn)生的氨和 H2O2對細(xì)胞有毒性；LAAO存在兩種形式, 一種有活性,另一種無活性,這取決于溫度、底物的存在和pH等；蛋白質(zhì)表達(dá)時(shí)缺少一些修飾,這可能導(dǎo)致產(chǎn)生不溶性的蛋白質(zhì)．本研究通過構(gòu)建竹葉青蛇毒L-氨基酸氧化酶Pet28a(+)-LAAO表達(dá)載體,轉(zhuǎn)化表達(dá)菌株BL21(DE3)進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá),經(jīng)SDS-PAGE分析發(fā)現(xiàn)表達(dá)蛋白主要以包涵體表達(dá),提示在大腸桿菌中表達(dá)多為無活性的包涵體形式,須經(jīng)洗滌、溶解、復(fù)性處理后才能得到具有生物活性的重組蛋白[12]．

(3)本次實(shí)驗(yàn)建立鼻咽癌、人宮頸癌和卵巢癌荷瘤模型,純化重組蛋白腹腔注射荷瘤小鼠進(jìn)行治療,計(jì)算重組蛋白的抑瘤率和延長載瘤小鼠的存活時(shí)間,重組蛋白低、中、高劑量組荷瘤小鼠生命延長率與陰性對照組(PBS)相比較均表現(xiàn)為差異極顯著(P<0.01),低、中和高劑量組與陰性對照組比較,差異均極顯著(P<0.01),研究結(jié)果均能揭示重組蛋白可顯著抑制小鼠實(shí)體瘤的生長和提高荷瘤小鼠生命延長率．但筆者觀察重組LAAO組和蛇毒分離LAAO組小鼠，可見小鼠心肌水腫、并有少許的紅細(xì)胞滲出,肝細(xì)胞壞死，肺出血、充血,肺泡間隔毛細(xì)血管充血，脾臟和腎臟充血等癥狀,這說明重組蛋白對小鼠具有一定的毒性,用于臨床還需進(jìn)一步研究．

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