張建瑛 張海峰 田新華 郭樹(shù)平

(黑龍江省林業(yè)科學(xué)研究所，哈爾濱 150080)

長(zhǎng)白落葉松(LarixolgensisHenry.)為松科、落葉松屬的落葉喬木，樹(shù)干通直、圓滿(mǎn),木材耐腐、耐濕，具有生長(zhǎng)迅速、適應(yīng)性強(qiáng)、分布廣等特點(diǎn)，是電業(yè)、煤礦、造船、橋梁、鐵路等方面的優(yōu)良用材。同時(shí)，還是北方針葉樹(shù)種中的一個(gè)重要造紙材料。長(zhǎng)白落葉松主要靠種子繁殖，由于生長(zhǎng)周期長(zhǎng)，結(jié)實(shí)不好，種子敗育嚴(yán)重，在繁殖過(guò)程中優(yōu)良性狀無(wú)法控制，有些甚至丟失。近年來(lái)，隨著資源的減少及在生產(chǎn)中常規(guī)種子繁殖困難問(wèn)題的突出，急需尋求一種新的科學(xué)方法加速這一植物資源的繁殖。因此，通過(guò)組織培養(yǎng)的方法培育苗木成為長(zhǎng)白落葉松繁育工作中的重點(diǎn)。為此，本文通過(guò)對(duì)長(zhǎng)白落葉松種源、基本培養(yǎng)基、激素等因素的研究進(jìn)行愈傷組織的誘導(dǎo)，從中篩選出最優(yōu)技術(shù)參數(shù)組合為今后用愈傷組織分化為不定芽或體細(xì)胞胚等途徑提供豐富材料，為進(jìn)一步形成完整植株做準(zhǔn)備。

1 材料與方法

長(zhǎng)白落葉松分別在2009年、2010年、2011年黑龍江省哈爾濱市延壽縣林業(yè)局(HY)、黑龍江省肇東市林業(yè)局(HZ)、黑龍江省五常市林業(yè)局(HW)、黑龍江省鶴崗市林業(yè)局(HH)取材。

在超凈工作臺(tái)上將種子先用75%酒精浸泡30s(2次),再用0.1%升汞溶液消毒10min，取出后用無(wú)菌水漂洗4～6次，然后用無(wú)菌濾紙將外植體表面的水吸干,分別接種于不同激素濃度配比的誘導(dǎo)培養(yǎng)基上。培養(yǎng)溫度(25±2)℃，光照12h·d-1，光照強(qiáng)度1 500～2 000lx。以MS為基本培養(yǎng)基，添加不同種類(lèi)和不同質(zhì)量濃度的激素(見(jiàn)表1，激素單位均為mg/L)，蔗糖為3%,瓊脂為0.6%,水解酪蛋白500mg/L，谷氨酰胺1 000mg/L。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同激素組合下對(duì)長(zhǎng)白落葉松愈傷組織的誘導(dǎo)影響

將長(zhǎng)白落葉松2011年五常取材的成熟合子胚接種到20

表1 不同激素配比組合

種誘導(dǎo)培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，不同激素組合對(duì)愈傷組織的誘導(dǎo)影響很大(見(jiàn)表2)。一周后2號(hào)培養(yǎng)基中外植體子葉變綠，開(kāi)始萌發(fā)，繼而形成單株小苗。14號(hào)培養(yǎng)基中在接種后10d左右切口處有愈傷組織出現(xiàn)，呈黃綠色，生長(zhǎng)良好，誘導(dǎo)率最高達(dá)100%；一個(gè)月后在愈傷組織中發(fā)現(xiàn)不定芽，其不定芽誘導(dǎo)率達(dá)33.3%。其他誘導(dǎo)出愈傷組織在20d以后才開(kāi)始陸續(xù)出現(xiàn),其余外植體褐化繼而死亡，無(wú)愈傷組織出現(xiàn)。

不添加激素BA和2,4-D的培養(yǎng)基均不能誘導(dǎo)出愈傷組織，而添加了2,4-D的培養(yǎng)基能夠誘導(dǎo)出愈傷組織，但個(gè)別培養(yǎng)基誘導(dǎo)時(shí)間較長(zhǎng)，且誘導(dǎo)率很低；在2,4-D為0.1mg/L和BA2.0mg/L愈傷組織的誘導(dǎo)效果較好，達(dá)100%。這說(shuō)明，2,4-D具有很高的愈傷組織誘導(dǎo)能力，它的添加能夠刺激愈傷組織的形成。同時(shí)，適當(dāng)?shù)纳L(zhǎng)素與細(xì)胞分裂素的比例更有利于愈傷組織的誘導(dǎo)。

表2 不同激素組合下對(duì)長(zhǎng)白落葉松愈傷組織的誘導(dǎo)影響

續(xù)表

編號(hào)生 長(zhǎng) 狀 態(tài)誘導(dǎo)率(%)14形成紅色、白色兩種愈傷組織,胚根處變綠,分化不定芽10015形成紅色、白色兩種愈傷組織,胚根處變綠10016形成紅色、白色兩種愈傷組織,胚根處變綠10017外植體表面褐化,死亡018形成紅色、白色兩種愈傷組織,胚根處變綠9819外植體表面褐化,死亡020外植體表面褐化,死亡0

2.2 不同產(chǎn)地對(duì)長(zhǎng)白落葉松愈傷誘導(dǎo)的影響

將不同產(chǎn)地的長(zhǎng)白落葉松成熟合子胚(2011年)接種在13-16號(hào)培養(yǎng)基上，一個(gè)月統(tǒng)計(jì)愈傷組織誘導(dǎo)情況(見(jiàn)表3)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，隨著不同地域的區(qū)別，其愈傷誘導(dǎo)情況也不相同，從緯度上自北向南在外植體啟動(dòng)的速度為HW>HH>HZ>HY。在培養(yǎng)條件相同的情況下，四個(gè)產(chǎn)地的成熟合子胚均能誘導(dǎo)出愈傷組織，但五常產(chǎn)地的成熟合子胚的誘導(dǎo)率最高(100%)，約為哈爾濱延壽、哈爾濱肇東產(chǎn)地的5倍左右，而與鶴崗產(chǎn)地?zé)o太多差別。

表3 不同產(chǎn)地對(duì)長(zhǎng)白落葉松愈傷組織誘導(dǎo)的影響

2.3 不同年份對(duì)長(zhǎng)白落葉松愈傷誘導(dǎo)的影響

將五常產(chǎn)地的長(zhǎng)白落葉松合子胚接種后發(fā)現(xiàn)，不同年限也會(huì)導(dǎo)致愈傷組織誘導(dǎo)的差異(見(jiàn)表4)。隨著保存時(shí)間的延長(zhǎng)，其愈傷組織誘導(dǎo)率也有所下降，可說(shuō)明種子生活力下降嚴(yán)重影響長(zhǎng)白落葉松組織培養(yǎng)，影響其愈傷組織的分化情況。

表4 不同年份對(duì)長(zhǎng)白落葉松愈傷組織誘導(dǎo)的影響

3 結(jié)論與討論

經(jīng)試驗(yàn)證明，長(zhǎng)白落葉松以采集年限越近、地區(qū)為五常的誘導(dǎo)愈傷組織效果最好，成熟合子胚在MS+BA2.0mg/L+2,4-D0.1mg/L上愈傷組織誘導(dǎo)率高達(dá)100%，并能分化不定芽。因此，我們可以選其進(jìn)行長(zhǎng)白落葉松下一步組織培養(yǎng)研究。

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