姚婧等

摘 要 以火焰蘭的莖段為外植體，探討不同植物激素配比對莖段側(cè)芽萌發(fā)和生根壯苗的影響，以及不同培養(yǎng)基配方和不同添加劑對火焰蘭生長過程中褐化現(xiàn)象的抑制作用。結(jié)果表明：最佳側(cè)芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+6-BA 3.0 mg/L+NAA 0.5mg/L，培養(yǎng)40 d，后誘導(dǎo)率可達(dá)97.95%；添加活性炭0.3 g/L可有效抑制側(cè)芽誘導(dǎo)過程中的褐化現(xiàn)象，褐化率僅為13.17%；1/2 MS+6-BA 0.2 mg/L+NAA 1.0 mg/L+AC 0.5 g/L生根效果最好，生根率達(dá)到100%，且植株生長健壯。利用火焰蘭莖段側(cè)芽能夠離體再生獲得瓶苗，建立高效的火焰蘭莖段為外植體的離體再生體系，為擴(kuò)大拓寬火焰蘭組織培養(yǎng)外植體來源和快速繁殖技術(shù)提供技術(shù)支撐。

關(guān)鍵詞 火焰蘭 ；離體再生 ；褐化 ；莖段側(cè)芽

分類號 Q943.1；S682.31

Abstract The present study establishing efficient and stable Renanthera in vitro regeneration system by using stem buds， aim to expand the Renanthera explant sources and provide the technical support of rapid propagation technique of Renanthera. This research by using stem buds of Renanthera as explants， discusses the effect of different plant growth regulator combinations on the stem bud's inducing and rooting culture， and inhibitory effect of different medium and different additives on the growth process of Renanthera imschootiana Browning. Result：The optimal culture medium for stem bud inducement was MS+6-BA 3.0 mg/L+NAA 0.5mg/L， with the inductivity rate was 87.5% after 40 days of induction；adding activated carbon can control browning phenomenon of stem bud inducing culture effectively， with the browning rate was 13.17%； the optimal culture medium for rooting was 1/2MS+6-BA 0.2 mg/L+NAA 1.0mg/L+AC 0.5 g/L， with the rooting rate was 100%. Using the stem buds of Renanthera can in vitro regenerate plantlets， it's lay the foundation for the rapid propagation of Renanthera.

Keywords Renanthera coccinea Loureiro ； in vitro regeneration ； browning ； stem buds

火焰蘭（Renanthera coccinea Loureiro）為蘭科（Orchidaceae）火焰蘭屬（Renanthera Loureiro）的多年生附生或半附生草本，單軸莖，大型圓錐花序、著花多朵，多紅色或橙黃色[1]，鮮亮艷麗，可廣泛用于切花、盆花、立籬和園林布景等，具有極高的園藝應(yīng)用價(jià)值及育種價(jià)值，自然分布于中國南部熱帶地區(qū)及東南亞地區(qū)。火焰蘭傳統(tǒng)的繁殖方式為切莖繁殖，繁殖系數(shù)較低，不利于產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)，應(yīng)用組織培養(yǎng)進(jìn)行繁殖可在短時(shí)間內(nèi)獲得大批種苗。目前已有利用火焰蘭屬的葉、莖尖、腋芽來誘導(dǎo)類原球莖的報(bào)道， Seeni和Latha[2]以云南火焰蘭葉片及莖尖為外植體再生出試管苗；Laishram和Devi[3]以火焰蘭的莖尖、腋芽和葉片為外植體，成功誘導(dǎo)出PLB；Wu等[4]利用火焰蘭葉片進(jìn)行了火焰蘭的快速繁殖。陳之林等[5-6]分別以火焰蘭、云南火焰蘭、豹斑火焰蘭等原生種的種莢進(jìn)行無菌播種，獲得火焰蘭試管苗。目前，以火焰蘭莖段為外植體進(jìn)行組織培養(yǎng)的研究尚未見報(bào)道。因此，本研究以火焰蘭莖段為外植體，旨在建立莖段離體再生培養(yǎng)體系，充實(shí)國內(nèi)火焰蘭離體培養(yǎng)技術(shù)，為火焰蘭的快速繁殖提供技術(shù)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

火焰蘭采自海南大學(xué)農(nóng)學(xué)院教學(xué)實(shí)踐基地海南野生蘭花種質(zhì)資源圃的火焰蘭莖段。

1.2 方法

1.2.1 外植體消毒方法

將火焰蘭莖段用自來水沖洗干凈后剝?nèi)ト~片，露出腋芽，切成約2 cm的帶腋芽莖段，用0.1%的升汞溶液浸泡8 min，無菌水沖洗4～5遍。

1.2.2 側(cè)芽的誘導(dǎo)

將消毒后的莖段接種于6-BA（1.0、3.0、5.0 mg/L）和NAA（0.2、0.5、1.0 mg/L）的9個(gè)處理組合的MS培養(yǎng)基中，分別統(tǒng)計(jì)接種25 d的側(cè)芽誘導(dǎo)率和45 d的誘導(dǎo)率、褐化率和側(cè)芽長度，公式如下：

側(cè)芽誘導(dǎo)率=側(cè)芽萌動數(shù)/接種外植體總數(shù)×100%；

褐化率=褐化外植體數(shù)/接種外植體總數(shù)×100%。

1.2.3 不同基本培養(yǎng)基對莖段褐化的影響

將莖段分別接種于MS、1/2 MS、MPR[3]、VW等4種培養(yǎng)基中，分別添加6-BA 3.0 mg/L，NAA 0.5 mg/L。接種25 d后觀察生長情況，第40天統(tǒng)計(jì)誘導(dǎo)率、褐化率和生長狀況。

1.2.4 不同添加劑對莖段褐化的影響

將莖段接種于對照、分別添加0.3 g/L活性炭（AC）或0.5 g/L抗壞血酸（VC）的MS+6-BA 3.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L的基本培養(yǎng)基，接種25 d后觀測生長情況，40 d統(tǒng)計(jì)誘導(dǎo)率、褐化率和生長狀況。

1.2.5 繼代增殖培養(yǎng)

將誘導(dǎo)出側(cè)芽的莖段切去側(cè)芽后接種于6-BA（1.0、3.0 mg/L）和NAA（0.2、0.5 mg/L）的4個(gè)處理組合，并添加了0.3 g/L活性炭MS培養(yǎng)基中，接種45 d分別統(tǒng)計(jì)增殖不定芽個(gè)數(shù)、增殖系數(shù)。

增殖系數(shù)=分化增殖的芽數(shù)/接種的芽數(shù)。

1.2.6 壯苗生根培養(yǎng)

將誘導(dǎo)出的1.5 cm長的側(cè)芽接種于分別添加0.5 mg/L或1.0 mg/L NAA 激素的1/2 MS+6-BA 0.2 mg/L+AC 0.5 g/L培養(yǎng)基上進(jìn)行壯苗生根培養(yǎng)，第25天統(tǒng)計(jì)葉片數(shù)、生根率、根數(shù)和株高。

生根率=（生根小苗數(shù)/接種的小苗總數(shù)）×100%。

以上試驗(yàn)每處理設(shè)3次重復(fù)，每處理接種20瓶，每瓶接種1個(gè)莖段；培養(yǎng)溫度26～28℃，光照12 h/d，光照強(qiáng)度2 000 lx。

1.2.7 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)與分析

采用SAS 9.2軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，其中，誘導(dǎo)率、褐化率和生根率經(jīng)反正弦轉(zhuǎn)換后進(jìn)行方差分析，多重比較采用Duncan測驗(yàn)法。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同激素配比對火焰蘭側(cè)芽誘導(dǎo)的影響

不同激素配比對火焰蘭側(cè)芽誘導(dǎo)的方差分析結(jié)果見表1。培養(yǎng)25 d后，每個(gè)處理都誘導(dǎo)出側(cè)芽，其中處理5的誘導(dǎo)率顯著高于其它處理，且側(cè)芽生長較粗壯；但是培養(yǎng)45 d后，處理4、5和9之間的誘導(dǎo)率最高，都達(dá)95%以上且差異不顯著，側(cè)芽長度都達(dá)到1.2 cm以上，明顯高于其它處理，處理5側(cè)芽較其他兩處理生長粗壯生命力旺盛；各處理褐化率均較高且處理9的褐化率顯著高于處理4和處理5。綜合考慮，處理5 （MS+6-BA 3.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L）為側(cè)芽誘導(dǎo)的最佳培養(yǎng)基，側(cè)芽萌動早，誘導(dǎo)率高，側(cè)芽長勢好。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，火焰蘭莖段離體培養(yǎng)存在嚴(yán)重的褐化現(xiàn)象，不利側(cè)芽的再生培養(yǎng)，因此，下面對褐化問題進(jìn)行探討和實(shí)驗(yàn)。

2.2 基本培養(yǎng)基對莖段褐化的影響

從表2可以看出，不同處理的側(cè)芽誘導(dǎo)率都較高（95%以上），且差異不顯著，說明不同基本培養(yǎng)基對火焰蘭側(cè)芽誘導(dǎo)率影響不大，但各處理的褐化率仍較高（大于80%）差異不顯著。

從圖1-A和1-B可見，接種25 d內(nèi)MPR培養(yǎng)基較其他處理的褐化程度低，但在培養(yǎng)40 d之后各處理均嚴(yán)重褐化?？梢姷望}濃度的培養(yǎng)基僅在培養(yǎng)初期能減輕褐化，但無法徹底解決誘導(dǎo)過程中的褐化問題，因此考慮增加添加劑來解決褐化問題。

2.3 不同添加劑對莖段褐化的影響

以MS為基本培養(yǎng)基添加AC或VC的培養(yǎng)40 d狀況（表3）可以看出，添加了添加劑的處理褐化率極顯著低于對照，且AC的褐化率極顯著低于VC，并且側(cè)芽的長勢良好，各處理誘導(dǎo)率均較高。

從圖2-A，2-B可見，接種后25 d內(nèi)VC和AC都能有效抑制褐化，但在培養(yǎng)40 d之后添加VC的培養(yǎng)基的褐化加重，添加AC的培養(yǎng)基褐化現(xiàn)象不明顯。綜上所述，添加AC誘導(dǎo)率高，且芽體長勢最好，對褐化現(xiàn)象具有顯著的抑制作用。

2.4 不同激素配比對火焰蘭莖段不定芽增殖誘導(dǎo)的影響

通過不同激素配比對火焰蘭莖段不定芽增殖誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，各處理中誘導(dǎo)出不定芽的瓶數(shù)較少，為2～3瓶，每個(gè)莖段誘導(dǎo)出的不定芽數(shù)為3～5個(gè)，各處理部分莖段基部被褐化（圖2-A）。統(tǒng)計(jì)方差分析結(jié)果（表4）可見，各處理間的增殖系數(shù)差異不顯著，且均較低。說明通過直接誘導(dǎo)不定芽的增殖方式不太適合火焰蘭。

2.5 不同濃度NAA對火焰蘭壯苗生根的影響

從表5可見，1.0 mg/L NAA的生根率、株高均顯著高于0.5 mg/L NAA的，且試管苗長勢更健壯。各處理對誘導(dǎo)出的試管苗葉片數(shù)和根數(shù)差異不顯著。因此，火焰蘭最佳生根培養(yǎng)基為1/2 MS+6-BA 0.2 mg/L+NAA 1.0 mg/L+AC 0.5 g/L。

2.6 煉苗移栽

將長至2 cm以上瓶苗（圖3-B）置于溫棚中煉苗，1周后取出用自來水洗凈附著的培養(yǎng)基后，放置于1 000倍多菌靈溶液中浸泡20 min，再用被自來水浸泡3 h的水苔包裹住苗根部，種植于5 cm×5 cm 小盆中（圖3-E）。保持適宜濕度，置于陰涼通風(fēng)處，進(jìn)行正常水、肥、藥管理。移栽煉苗20 d成活率高達(dá)98%以上。

3 結(jié)論與討論

火焰蘭為單軸莖蘭花，植株上極少發(fā)育側(cè)株，常規(guī)繁殖方式為切莖繁殖，繁殖系數(shù)低。組織培養(yǎng)技術(shù)是火焰蘭快速繁殖的主要手段。以種子為外植體無菌播種獲得實(shí)生苗不能良好地保持母本植株的品種特性，導(dǎo)致種苗質(zhì)量參差不齊[7]。通過誘導(dǎo)原球莖之后獲得再生植株，成苗速度較慢，多次繼代后存在一定的變異率。前人研究表明，通過誘導(dǎo)頂芽或腋芽獲得再生植株的擴(kuò)繁技術(shù)發(fā)生體細(xì)胞變異的幾率較低，是目前最穩(wěn)定、最能保持優(yōu)良性狀的離體培養(yǎng)方式[8-10]，且繁殖時(shí)間短，出苗快。本研究以火焰蘭側(cè)芽莖段為外植體成功獲得試管苗，成苗速度快，周期短，且不易發(fā)生變異。

蘭科植物在離體培養(yǎng)過程中容易出現(xiàn)不同程度的褐化問題[11-12]。聶衛(wèi)卓等[13]發(fā)現(xiàn)：降低無機(jī)鹽的濃度和使用低鹽培養(yǎng)基，較適合蘭花的組織培養(yǎng)；AC能有效防止蝴蝶蘭芽苗的褐化現(xiàn)象。陳瑤瑤等[15]發(fā)現(xiàn)，VC 對防止蝴蝶蘭花梗腋芽誘導(dǎo)過程中外植體褐化的效果較好。本研究結(jié)果顯示，使用低鹽濃度MPR的培養(yǎng)基和添加VC僅在培養(yǎng)初期抑制莖段外植體的褐化，不能有效解決褐化問題，且需要頻繁繼代，工作量大。而添加AC可以有效減輕火焰蘭褐化，對其側(cè)芽誘導(dǎo)及生長有利。

蘭花組織培養(yǎng)過程中增殖培養(yǎng)方法常采用莖段誘導(dǎo)不定芽或誘導(dǎo)原球莖。王麗麗等[16]采用古巴蘭的莖段成功誘導(dǎo)出原球莖。本研究通過火焰蘭莖段誘導(dǎo)產(chǎn)生不定芽進(jìn)行增殖效果較差，可以嘗試采用莖段側(cè)芽誘導(dǎo)原球莖的方法進(jìn)行火焰蘭增殖誘導(dǎo)。

本研究以火焰蘭莖段側(cè)芽為外植體成功地誘導(dǎo)出了完整的植株，方法簡單，加快了成苗速度；通過添加活性炭的方法有效地解決了莖段誘導(dǎo)過程中的褐化問題，以莖段為外植體的離體培養(yǎng)已成為最穩(wěn)定有效的快繁方法。

參考文獻(xiàn)

[1] 陳心啟，劉仲健，朱光華，等. Flora of China.Orchidaceae[M]. 2009.

[2] Seeni， Latha PG. Foliar regeneration of the endangered red vanda， Renanthera imschootiana Rolfe （Orchidaceae）[J]. Plant cell， tissue and organ culture， Springer， 1992， 29（3）： 167-172.

[3] Ardiui J. Micropmpagafion of orchids， 2 volume set[M]. Second Edition.Oxford，UK： Wiley-Blackwell， 2008： 1 049-1 066.

[4] Wu K L， Zeng S J， Teixeira da Silva JA， et al. 2012. Efficient regeneration of Renanthera Tom Thumb ‘Qilin from leaf explants[J]. Sci. Hortic，135： 194-201.

[5] 陳之林，曾宋君，黃向力，等. 火焰蘭的種子培養(yǎng)和試管育薊苗[J]. 植物生理學(xué)通訊，2005，41（2）：195.

[6] 周 俊，吳坤林，陳之林，等. 豹斑火焰蘭的離體快速繁殖[J]. 植物生理學(xué)通訊，2008，44（2）：283-284.

[7] 曹孜義，劉國民. 實(shí)用植物組織培養(yǎng)技術(shù)教程[M]. 蘭州：甘肅科學(xué)技術(shù)出版社， 2002：179-181.

[8] Martins M， Sarmento D， Oliveira MM. Genetic stability of micropropagated almond plantlets，as assessed by RAPD and ISSR markers[J]. Plant Cell Reports， 2004， 23（7）： 492-496.

[9] Renau-Morata B， Nebauer SG， Arrillaga I， et al. Assessments of somaclonal variation in micropropagated shoots of Cedrus：consequences of axillary bud breaking[J]. Tree Genetics & Genomes， 2005， 1（1）： 3-10.

[10] Sharma S， Bryan G， Winfield M， et al. Stability of potato （Solanum tuberosum L.） plants regenerated via somatic embryos， axillary bud proliferated shoots， microtubers and true potato seeds：a comparative phenotypic， cytogenetic and molecular assessment[J]. Planta， 2007， 226（6）： 1 449-1 458.

[11] 孔祥瑩，金雪花. 大花蕙蘭原球莖誘導(dǎo)培養(yǎng)影響因素及褐化防治的研究[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，41（20） ：8 470-8 471，8 500.

[12] 向立容，祁 翔，王濟(jì)紅. 文心蘭叢生芽繼代增殖關(guān)鍵技術(shù)研究[J]. 貴州科學(xué)，2014，32（1）：62-67.

[13] 聶衛(wèi)卓，貝麗霞. 蝴蝶蘭葉片組織培養(yǎng)中抗褐化的研究[J]. 黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，20（1）：28-31.

[14] 劉麗鳳，王景雪. 蝴蝶蘭快速繁殖技術(shù)的研究[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，41（29）：11 601-11 603.

[15] 陳瑤瑤，莊衛(wèi)東，黃枝英，等. 蝴蝶蘭花梗腋芽誘導(dǎo)及防褐化的研究[J]. 福建熱作科技，2010，35（3）：1-3.

[16] 王麗麗，曹魏魏，高新龍，等. 古巴蘭的莖段原球莖誘導(dǎo)與植株再生的研究[J]. 生物學(xué)通報(bào)，2013，48（1）：48-52.