楊 柳，王 瑞，崔建華張占平，桂俊豪，高 亮，何 江，余伍忠＊

（1.蘭州軍區(qū)烏魯木齊總醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)研究所，新疆 烏魯木齊830000；2.解放軍第18醫(yī)院高山病研究所，新疆 葉城844000；3.解放軍第12醫(yī)院檢驗(yàn)科，新疆 疏勒844000）

在生物學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，高原系指海拔3000m以上、能激發(fā)生物體（包括人、動(dòng)植物以及微生物）能產(chǎn)生明顯的生物效應(yīng)環(huán)境和高度。高原環(huán)境是地球上一個(gè)特殊的生態(tài)環(huán)境系統(tǒng)，其獨(dú)特的氣候特征引發(fā)的連鎖應(yīng)激反應(yīng)在系統(tǒng)、器官和分子細(xì)胞水平甚至基因水平均對(duì)機(jī)體具有深刻的影響［1］。目前高原醫(yī)學(xué)的研究在高原生理、急性高原病、高原肺水腫、高原營(yíng)養(yǎng)等方面進(jìn)展很快，但有關(guān)高原環(huán)境暴露的細(xì)胞遺傳學(xué)損傷影響的研究仍然有限。從細(xì)胞遺傳學(xué)及人類健康保護(hù)的角度出發(fā)，客觀評(píng)估高原惡劣環(huán)境對(duì)人體健康狀況的影響，有助于科學(xué)制定相關(guān)防護(hù)措施，有重要的經(jīng)濟(jì)和國(guó)防建設(shè)意義。

本文利用外周血淋巴細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)、姐妹染色單體交換和微核生成分析技術(shù)，對(duì)移居高原地區(qū)青年男性的相關(guān)細(xì)胞遺傳學(xué)指標(biāo)進(jìn)行觀察分析。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 觀察組選擇駐守在海拔5000－5400米高原地區(qū)某部男性官兵67人，年齡18－25歲，分別在進(jìn)入高原地區(qū)之前及一年后進(jìn)行追蹤調(diào)查，因各種原因失訪16人，實(shí)際完成51人；對(duì)照組選擇同期入伍駐守海拔800米左右地區(qū)某部男性官兵53人，年齡18－25歲之間。

所有研究對(duì)象在了解內(nèi)容并簽署了知情同意書后進(jìn)行了相應(yīng)的體格檢查和病史調(diào)查，排除放射線接觸史及其他明顯致畸因素的影響。

1.2 研究方法

1.2.1 微量外周血淋巴細(xì)胞培養(yǎng)及淋巴細(xì)胞微核標(biāo)本制作方法與分析 采用胞質(zhì)分裂阻斷微核法（Cytokinesis－block micronucleus method）檢測(cè)微核細(xì)胞。具體方法如下：將肝素抗凝靜脈血0.4ml注入含20%胎牛血清和PHA的RPMI1640培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)至44h，加入細(xì)胞松弛素B（Cyt－B），終濃度為4.Oμg／ml，繼續(xù)培養(yǎng)至72h，收獲細(xì)胞。1000 rpm離心10分鐘；棄上清，加入0.044mol／L的KCl低滲液8ml，混勻，置37℃水浴5分鐘；加入新鮮配置的Carnoy’s固定液0.3ml，混勻，靜置2分鐘；1000rpm離心10分鐘后棄上清，彈指法混勻沉淀物，再加入8mlCarnoy’s固定液，混勻，固定5 min；1000rpm離心10分鐘后棄上清，加入數(shù)滴固定液，混勻；氣干法制片，晾干；以pH6.8的PBS配置1∶10的Giemsa染液對(duì)標(biāo)本染色12min，蒸餾水沖洗、晾干；微核觀察與分析：于油境下，選擇胞核、胞質(zhì)完整，著色清晰的淋巴細(xì)胞，盲法觀察微核（微核的存在狀態(tài)及判斷方法：存在于胞質(zhì)中、與主核完全脫離、呈圓形或橢圓形、邊緣光滑、著色與主核一致 、大小為主核1／3以下的小核）出現(xiàn)頻率。每一份樣本分析1000個(gè)細(xì)胞核。微核率以千分率表示。

1.2.2 姐妹染色單體交換（SCE）標(biāo)本制作步驟及分析 外周血淋巴細(xì)胞接種同上，培養(yǎng)一開始即加入BrdU液（終濃度至10μg／ml培養(yǎng)液），充分混勻；以不透光黑紙包裹培養(yǎng)物，于暗處繼續(xù)培養(yǎng)50 h；加秋水仙液（終濃度至0.2μg／ml培養(yǎng)液）處理2 h；棄上清，加入0.044mol／L的 KCl低滲液8ml，混勻，置37℃水浴5分鐘；加入新鮮配置的Carnoy’s固定液0.3ml，混勻，靜置2分鐘；1000rpm離心10分鐘后棄上清，彈指法混勻沉淀物，再加入8ml－Carnoy’s固定液，混勻，固定5min；1000rpm離心10分鐘后棄上清，加入數(shù)滴固定液，混勻；氣干法制片，標(biāo)本置室溫放置2～3天；差異化染色前1天，將標(biāo)本玻片置37℃恒溫箱過(guò)夜；次日，以2×SSC液封片，水蒸氣熏蒸及紫外線照射30min均按本室常規(guī)進(jìn)行，蒸餾水沖洗，4%的Giemsa液染色10min后即可。

鏡檢：選擇在加入BrdU后經(jīng)過(guò)2個(gè)復(fù)制周期、姐妹染色單體差異化著色清晰、染色體分散良好、染色體數(shù)目完整且長(zhǎng)短適宜的中期分裂相，計(jì)數(shù)發(fā)生SCE的次數(shù)。每一份標(biāo)本分析40個(gè)中期分裂相，計(jì)算每個(gè)細(xì)胞的SCE平均數(shù)。SCE計(jì)數(shù)原則為：染色體末端的交換計(jì)為1次交換，短臂或長(zhǎng)臂的中間發(fā)生的交換計(jì)為2次交換。

2 結(jié)果

結(jié)果顯示，觀察組駐守高原前微核細(xì)胞率和微核率分別為0.41±0.03和0.49±0.03，與對(duì)照組的0.43±0.06和0.53±0.07相比無(wú)顯著差異（P＞0.05）；駐守高原一年后觀察組的微核細(xì)胞率和微核率有明顯升高，分別為0.60±0.05和0.76±0.07，與一年前相比有顯著性差異（P＜0.05），如表1示。

SCE頻率觀察組駐守高原前為6.25±1.24／細(xì)胞，分布范圍為4.1～8.9／細(xì)胞；對(duì)照組為6.61±1.29／細(xì)胞，分布范圍在4.2～8.7／細(xì)胞，兩組間無(wú)顯著性差異（P＜0.05）。駐守高原一年后觀察組SCE頻率為8.93±1.52／細(xì)胞，分布范圍為4.9～10.6／細(xì)胞，與一年前相比有顯著性差異（P＜0.05），如表2示。

表1 移居高原地區(qū)青年男性微核率的變化

表2 移居高原地區(qū)青年男性SCE頻率的變化

3 討論

高原惡劣環(huán)境是人們進(jìn)行高原作業(yè)或執(zhí)行任務(wù)時(shí)不得不面臨的自然因素，高原環(huán)境對(duì)人體健康影響的不利因素主要是由于其獨(dú)特的氣候特點(diǎn)如空氣稀薄、氧分壓低、日光輻射強(qiáng)、寒冷干燥風(fēng)大等，人進(jìn)入高原后所處的內(nèi)外環(huán)境是導(dǎo)致組織結(jié)構(gòu)和功能變化的最主要的因素。我國(guó)高原地域遼闊，邊境線長(zhǎng)，經(jīng)濟(jì)和國(guó)防戰(zhàn)略地位十分重要，對(duì)移居高原人群的醫(yī)學(xué)研究尤為重要。我們?cè)谝酝难芯恐邪l(fā)現(xiàn)：高原環(huán)境中移居人群的染色體畸變率明顯高于低海拔地區(qū)和世居高原人群，提示高海拔地區(qū)的低氧和高本底輻射暴露是造成移居高原地區(qū)人群染色體畸變率增高的可能原因［2］。在本文中，我們采用自身前后對(duì)照的方法，選擇駐守高原的某部官兵，對(duì)移居高原地區(qū)青年男性的細(xì)胞傳學(xué)損傷指標(biāo)進(jìn)行觀察分析，進(jìn)一步證實(shí)了上述結(jié)果。

外周血淋巴細(xì)胞微核測(cè)定是評(píng)價(jià)群體輻射效應(yīng)的一種簡(jiǎn)便而有價(jià)值的細(xì)胞遺傳學(xué)指標(biāo)［3］，淋巴細(xì)胞微核是細(xì)胞內(nèi)染色體斷裂或紡錘絲受影響而在細(xì)胞有絲分裂后期滯留在細(xì)胞核外的染色物質(zhì)。它來(lái)源于染色體斷片或有絲分裂過(guò)程中丟失的整條染色體，在有絲分裂后期不能納入子核而在細(xì)胞漿中形成單個(gè)或多個(gè)小核。微核實(shí)驗(yàn)?zāi)軝z測(cè)放射誘導(dǎo)產(chǎn)生的染色體完整性改變和染色體分離改變，微核率的大小直接反映染色體的損傷程度，與染色體畸變發(fā)生率呈正相關(guān)，也間接地代表受染色體損傷的狀況［4］。

我們采用胞質(zhì)分裂阻斷微核法（cytokinesisblock micronucleus method）［5］對(duì)移居高原地區(qū)青年男性的微核率進(jìn)行了檢測(cè)分析，結(jié)果顯示，觀察組駐守高原前微核細(xì)胞率和微核率分別為0.41±0.03和0.49±0.03，與對(duì)照組的0.43±0.06和0.53±0.07相比無(wú)顯著差異（P＞0.05）；駐守高原一年后觀察組的微核細(xì)胞率和微核率有明顯升高，分別為0.60±0.05和0.76±0.07，與一年前相比有顯著性差異（P＜0.05），提示高原環(huán)境對(duì)移居高原人體的微核率有明顯的增加作用。

姐妹染色單體交換（sister chromatid exchange，SCE）是指兩條姐妹染色單體在相同位置上發(fā)生的同等對(duì)稱的片段交換。SCE主要在DNA復(fù)制期間形成，所代表的是同源位點(diǎn)復(fù)制產(chǎn)物間的交換，標(biāo)志著染色體在DNA水平上存在不穩(wěn)定性損傷。SCE頻率是檢測(cè)遺傳不穩(wěn)定性和早期染色體DNA損傷極為靈敏的指標(biāo)，既可用于檢測(cè)各種誘變因素和致癌因素對(duì)人體DNA的損傷，又可作為探討染色體斷裂和修復(fù)機(jī)制的良好手段。SCE頻率增高表明染色體不穩(wěn)定或修復(fù)能力低下，意味著DNA受損［6］。本文結(jié)果顯示：觀察組駐守高原前SCE頻率為6.25±1.24／細(xì)胞，分布范圍為4.1～8.9／細(xì)胞；對(duì)照組為6.61±1.29／細(xì)胞，分布范圍在4.2～8.7／細(xì)胞，兩組間無(wú)顯著性差異（P＜0.05）；駐守高原一年后觀察組SCE頻率為8.93±1.52／細(xì)胞，分布范圍為4.9～10.6／細(xì)胞，與一年前相比有顯著性差異（P＜0.05），提示高原環(huán)境可能存在引起人體DNA損傷的因素。

微核和SCE分析技術(shù)簡(jiǎn)便、易操作，靈敏度高，現(xiàn)已成為遺傳毒理學(xué)中成熟的主要研究方法。本文利用可反映體內(nèi)有無(wú)染色體損傷的微核試驗(yàn)和反映體內(nèi)有無(wú)DNA損傷的姐妹染色單體交換（SCE）試驗(yàn)對(duì)移居高原的青年男性進(jìn)行了細(xì)胞遺傳學(xué)評(píng)價(jià)，結(jié)果提示高原環(huán)境對(duì)移居人群具有一定的遺傳損傷作用，長(zhǎng)期在高原環(huán)境作業(yè)可導(dǎo)致染色體斷裂和DNA損傷，但其詳細(xì)機(jī)制仍待進(jìn)一步研究。

雖然高原醫(yī)學(xué)的研究已經(jīng)取得了長(zhǎng)足的進(jìn)步和發(fā)展，但多數(shù)研究側(cè)重于高原生理、急性高原病、高原肺水腫、高原營(yíng)養(yǎng)等方面，并且目前對(duì)高原環(huán)境所致人體損傷的生物學(xué)機(jī)理、閾值效應(yīng)和健康危險(xiǎn)度原則等尚未得到完全理解。隨著分子生物學(xué)技術(shù)和危險(xiǎn)度評(píng)價(jià)方法的完善，將可能最終對(duì)高原暴露環(huán)境中的各種有害因素進(jìn)行全面科學(xué)地評(píng)估，全面、科學(xué)地闡明高原環(huán)境暴露對(duì)人體健康的影響及其機(jī)制，并尋求改善及防治方案，提高近、遠(yuǎn)期高原醫(yī)學(xué)防護(hù)水平，為我國(guó)高原開發(fā)和建設(shè)服務(wù)。

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