秦 健，吳榮富，杜 榮，楊亞群，張紅強，曹海霞，辛 香

（1.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，北京 海淀100193；2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)信息科學(xué)與工程學(xué)院電鏡中心，山西 太谷030801；3.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院家禽研究所，江蘇 揚州225003；4.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，山西 太谷030801）

胰島素是由胰島β細胞受內(nèi)源性或外源性物質(zhì)刺激而分泌的一種蛋白質(zhì)激素，是動物體內(nèi)降低血糖，促進糖原、脂肪、蛋白質(zhì)合成的重要激素，在機體的代謝調(diào)節(jié)和生長發(fā)育中起著重要作用。心肌是動物體的重要組成部分，是胰島素作用的一個重要靶器官。因此，研究胰島素對心肌發(fā)育的影響具有重要意義。有研究表明，胰島素可以改善糖尿病大鼠損傷的心肌超微結(jié)構(gòu)，對心肌具有保護作用［1］。胰島素早期干預(yù)對糖尿病大鼠心肌細胞具有抗凋亡作用［2］。然而，關(guān)于胰島素對正常動物心肌發(fā)育及其超微結(jié)構(gòu)的影響，特別是針對禽類的研究，則鮮見報道。本試驗旨在通過給雛雞注射適量胰島素，分析其對心肌發(fā)育及其超微結(jié)構(gòu)的影響，為進一步深入研究胰島素對心肌發(fā)育和代謝的分子細胞機制奠定基礎(chǔ)，也為在實踐中更好地利用胰島素抗應(yīng)激、抗疾病并促進生長提供依據(jù)。

1 試驗材料

1.1 試驗動物 選用16只體重約200g的健康雛雞，隨機分成兩組，常規(guī)飼養(yǎng)和管理，自然光照，自由采食和飲水。

1.2 主要試驗試劑 胰島素注射液（江蘇萬邦生化醫(yī)藥股份有限公司）、0.9%生理鹽水、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、四氧化鋨酸、0.1mol／L磷酸緩沖液、2.5%磷酸緩沖的戊二醛固定液、1%磷酸緩沖的四氧化鋨固定液、無水乙醇、無水硫酸銅、環(huán)氧丙烷、Epon812、DDSA、MNA、DMP－30、醋酸雙氧鈾、硝酸鉛、檸檬酸鈉。

1.3 主要儀器和器材 日本電子GEOL－1400透射電鏡、LEICA EM KMR2制刀機、LEICA EM UC6超薄切片機（Leica，Austria）、XTB－I型連續(xù)變倍體視鏡、DG／20－002型臺式干燥箱（重慶試驗設(shè)備廠制造）、SC－210F白雪牌商用陳列柜、SE202F型電子天平（上海奧豪斯儀器有限公司生產(chǎn)）、D系列超聲波清洗機（寧波新芝生物科技股份有限公司生產(chǎn)）、BCD－197KZ型新飛冰箱、SPR－1水平振蕩器。

2 試驗方法及分析

2.1 動物處理方法 試驗組8只雛雞每天定時腹腔注射1mL胰島素注射液（0.4單位／mL），對照組8只雛雞腹腔注射等體積生理鹽水。連續(xù)注射10d后，禁食，稱重，解剖取出心臟，稱重，并迅速剖出1mm3相同部位心室肌組織2塊，放入預(yù)冷的2.5%的戊二醛固定液中。

2.2 電鏡樣本制作及分析 在4℃2.5%戊二醛固定液固定24h，PBS漂洗；1%鋨酸固定液固定1.5 h，PBS漂洗；乙醇梯度脫水，環(huán)氧丙烷過渡，環(huán)氧丙烷和Epon812樹脂的混合液浸透2h；純Epon812樹脂浸透過夜、包埋，干燥箱中聚合48h；半薄切片定位，50～70nm超薄切片，醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛雙染色；JEOL－1400透射電鏡觀察拍照。心肌線粒體橫截面積采用Gantan Digital Micrograph軟件（Gatan Inc.USA）定量分析。

2.3 統(tǒng)計分析 試驗數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件處理，各組試驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±SD）表示。兩組間差異顯著性分析用兩樣本均數(shù)差別的t檢驗，P＜0.05為組間差異具有顯著性，P＜0.01為組間差異極顯著。作圖采用Excel 2007軟件。

3 試驗結(jié)果

3.1 試驗期末雛雞的體重和心肌重量 見表1。

表1 雛雞體重、心肌重和心體比

試驗期末，試驗組與對照組雛雞的體重、心肌重和心體比均差異不顯著（P＞0.05）（表1）。表明在本試驗的注射劑量和注射時間下，胰島素對雛雞的生長發(fā)育未產(chǎn)生顯著影響。

3.2 超微結(jié)構(gòu)觀察 8 000倍電鏡下觀察雛雞心肌肌原纖維超微結(jié)構(gòu)（圖1），對照組和試驗組均可見結(jié)構(gòu)完整的細胞核（N），核仁清晰，核染色質(zhì)均勻，結(jié)構(gòu)正常的線粒體（Mi），清晰完整的肌絲（mf），排列整齊的Z線，粗細均勻的肌節(jié)，A帶中有粗肌絲和細肌絲交錯排列，肌原纖維或肌絲之間可見糖原顆粒（Gl）。

定量分析結(jié)果表明，與對照組相比，試驗組肌細胞內(nèi)線粒體數(shù)量和面積均明顯增加（P＜0.05）（圖2和圖3）。

80 000倍電鏡下進一步觀察雛雞心肌細胞線粒體（Mi）超微結(jié)構(gòu)（圖4），對照組和試驗組均可見完整清晰的線粒體雙層膜結(jié)構(gòu)、內(nèi)膜向內(nèi)折疊形成許多嵴（Ci）、嵴長而密，呈平行排列，嵴間腔內(nèi)由無定形物質(zhì)或細粒狀物質(zhì)構(gòu)成，呈中等電子密度。與對照組相比，試驗組線粒體明顯變大，嵴更加清晰，并且嵴間腔面積增加，基質(zhì)更為豐富。

圖4 雛雞心肌超微結(jié)構(gòu) （80 000×）

4 討論與分析

胰島素通過調(diào)節(jié)物質(zhì)代謝和能量代謝對動物的生長發(fā)育等起著至關(guān)重要的作用。而線粒體作為動物細胞內(nèi)的能量轉(zhuǎn)換器，是細胞內(nèi)氧化磷酸化和形成ATP的主要場所。對人類和小鼠等哺乳動物的研究表明，胰島素與線粒體的發(fā)生及功能有關(guān)。有研究表明，胎牛骨骼肌中線粒體蛋白的含量與血清胰島素的增加呈正相關(guān)［3］。Pawlikowska等（2006）通過體外培養(yǎng)的細胞研究表明，線粒體是胰島素介導(dǎo)肌生成的必需細胞器，而胰島素又能刺激線粒體的發(fā)生和促進線粒體的功能［4］。

心肌細胞由于其高效的收縮功能，其線粒體含量比骨骼肌更為豐富，線粒體的氧化磷酸化是心肌能量的主要來源。而心肌細胞又含有大量胰島素受體，是典型的胰島素靶細胞。所以胰島素對心肌線粒體的發(fā)生及功能具有重要的意義。在心肌梗死小鼠，胰島素信號受損降低了線粒體的氧化功能［5］。另有研究表明，胰島素信號受阻明顯促進了小鼠心肌線粒體的氧化應(yīng)激和解偶聯(lián)［6］。本試驗短期內(nèi)給雛雞注射生理劑量的胰島素后對其體重和心體比雖未產(chǎn)生顯著影響（表1），但明顯影響了心肌的超微結(jié)構(gòu)，如糖原顆粒增加、線粒體數(shù)量增加和體積增大（圖1～4）。而且大量圖片的觀察結(jié)果表明，線粒體數(shù)量和體積增加的同時，線粒體的結(jié)構(gòu)也有所改善，如嵴間基質(zhì)面積增加。這些結(jié)果表明，適量補充生理劑量的胰島素可以通過增加線粒體的發(fā)生和提高線粒體的功能而改善正常雛雞心肌的代謝功能，從而提高雛雞的生長發(fā)育和抗應(yīng)激、抗疾病能力。胰島素增加線粒體數(shù)量和體積的原因可能是細胞對代謝加強的一種適應(yīng)性反應(yīng)。從小鼠等哺乳動物的一些研究結(jié)果推測，胰島素提高禽類心肌線粒體功能的機制，可能與下列因素有關(guān)：胰島素刺激可以激活PI3K－Akt途徑，誘導(dǎo)Akt磷酸化并促進Akt向心肌線粒體遷移［7］；胰島素信號可以通過維持線粒體生物發(fā)生和作用過程中的一些關(guān)鍵介質(zhì)如NAD＋／NADH比例等而加強線粒體電子傳遞鏈的完整性和活性［8］。有關(guān)胰島素促進線粒體發(fā)生和增殖機制的研究較少，而且禽類具有不同于哺乳動物的一些生理機制，因此有關(guān)生理劑量胰島素促進禽類心肌線粒體發(fā)生和功能的確切分子和細胞機制有待進一步研究。

［1］金秀平，吳云丹，崔路坤.甘精胰島素對糖尿病大鼠心肌纖維化及超微結(jié)構(gòu)的影響［J］.西安交通大學(xué)學(xué)報：醫(yī)學(xué)版，2009，30（6）：732－734.

［2］劉雅玲，江時森，程訓(xùn)民，等.胰島素抑制糖尿病大鼠心肌細胞凋亡的作用及機制［J］.解放軍醫(yī)學(xué)雜志，2010，35（7）：798－801.

［3］Pajak B，Pawlikowska P，Cassar－Malek I，etal.Abundance of some skeletal muscle mitochondrial proteins is associated with increased blood serum insulin in bovine fetuses［J］.Research in Veterinary Science，2010，89（3）：445－450.

［4］Pawlikowska P，Gajkowska B，Hocquette J F，etal.Not only insulin stimulates mitochondriogenesis in muscle cells，but mitochondria are also essential for insulin－mediated myogenesis［J］.Cell Proliferation，2006，39（2）：127－145.

［5］Sena S，Hu P，Zhang D F，etal.Impaired insulin signaling accelerates cardiac mitochondrial dysfunction after myocardial infarction［J］.Journal of Molecular and Cellular Cardiology，2009，46：910－918.

［6］Boudina S，Bugger H，Sena S，etal.Contribution of Impaired Myocardial Insulin Signaling to Mitochondrial Dysfunction and Oxidative Stress in the Heart［J］.Circulation，2009，119：1272－1283.

［7］Yang J Y，Yeh H Y，Lin K，etal.Insulin stimulates Akt translocation to mitochondria：Implications on dysregulation of mitochondrial oxidative phosphorylation in diabetic myocardium［J］.Journal of Molecular and Cellular Cardiology，2009，46：919－926.

［8］Cheng Zhiyong，Tseng Yolanda，White Morris F.Insulin signaling meets mitochondria in metabolism［J］.Trends in Endocrinology ＆ Metabolism，2010，21：589－598.