郜 原，薄聯(lián)鋒，武小椿，孫 柏，溫俊歌，孫 巖，徐志坤，張德禮

（西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院 獸醫(yī)微生物學(xué)與病毒學(xué)課程組病毒免疫與生物信息研究室，陜西 楊凌712100）

豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）是一種嚴(yán)重危害著我國乃至全世界養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展的豬免疫抑制性疾病，尤其是高致病性豬藍(lán)耳病的暴發(fā)，對我國養(yǎng)豬業(yè)造成了極大損失。但受限于病毒主要結(jié)構(gòu)蛋白GP5超變異性等原因，PRRSV 疫苗開發(fā)受到嚴(yán)重制約［1］，目前 microRNA（miRNA）的病毒調(diào)節(jié)作用引起人們廣泛關(guān)注。miRNA是一類小分子非編碼單鏈RNA，大小約18～25bp，成熟的miRNA在細(xì)胞內(nèi)和靶基因的3′端非編碼區(qū)（3′utr）互補(bǔ)，調(diào)節(jié)基因表達(dá)，抑制病毒復(fù)制。本試驗(yàn)旨在尋找豬體與PRRSV 3′utr發(fā)揮作用的miRNA，為PRRSV乃至高致病性豬藍(lán)耳病的防治探索新方法。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞系、血清與細(xì)胞培養(yǎng)基 豬臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞系（SUVEC）為西北農(nóng)林科技大學(xué)張彥明教授惠贈；胎牛血清購自HyClone；高糖DMEM購自Invitrogen公司。

1.2 主要酶、試劑與載體 內(nèi)切酶PmeⅠ、XhoⅠ，購自紐英倫生物技術(shù)（北京）有限公司；LipofectamineTM2000，購自Invitrogen公司；TaqDNA聚合酶；雙熒光素酶載體psiCHECKTM－2、雙熒光素酶檢測試劑盒，購自Promega公司。

1.3 miRNA、PRRSV 3′utr和引物的合成 人工合成ssc－miR－323、ssc－miR－105－1及兩者的抑制物inhibitor，由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成，同時(shí)合成陰性對照miRNA Control及相應(yīng)抑制物inhibitor control。

根據(jù)GenBank中公布的PRRSV JXA1株基因序列（GenBank登錄號：EF112445），獲得病毒3′utr序列，將兩端分別加上酶切位點(diǎn)PmeⅠ和XhoⅠ，送南京金斯瑞生物科技有限公司合成。用Primer軟件 設(shè) 計(jì) 1 對 3′utr引 物 P1：5′－ACCTCGAGTGGGCTGGCATTCTTTGG－3′； P2：5′－TGGTCGACAATTACGGCCGCATGGTTC－3′，由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，其中斜體部分為PmeⅠ和XhoⅠ酶切位點(diǎn)。

1.4 PRRSV 3′utr雙熒光素酶重組載體的構(gòu)建將公司合成并轉(zhuǎn)入pUC－3′utr的載體菌接于普通LB培養(yǎng)基中，37℃過夜搖起，提取質(zhì)粒，PmeⅠ／XhoⅠ37℃2h雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳，回收157bp大小的目的片段，與經(jīng)相同雙酶切處理的psiCHECKTM－2載體用T4連接酶4℃連接過夜，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5α，氨芐抗性篩選搖菌提取質(zhì)粒，PmeⅠ／XhoⅠ雙酶切鑒定及PCR鑒定，送往南京金斯瑞生物科技有限公司測序。

1.5 生物信息學(xué)預(yù)測與PRRSV 3′utr作用的潛在miRNA 根據(jù)miRBase公布的豬76條miRNA，結(jié)合Mirnada，RNAhybrid和RNA22三個(gè)網(wǎng)絡(luò)軟件，預(yù)測PRRSV 3′utr有潛在靶標(biāo)的豬miRNA，選出可能性最大的miRNAs進(jìn)行試驗(yàn)。

1.6 重組質(zhì)粒與miRNA轉(zhuǎn)染豬血管內(nèi)皮細(xì)胞（SUVEC） 大量搖菌，提取psiCHECK－utr和psi－CHECKTM－2質(zhì)粒。將合成的miRNAs及其抑制物分別與psiCHECK－utr質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染SUVEC，設(shè)立空載體對照，依照LipofectamineTM2000試劑說明轉(zhuǎn)染96孔板，各自設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，轉(zhuǎn)染設(shè)置組如下：1：psiCHECKTM－2vector，2：psiCHECK－utr，3：miRNA control；psiCHECK－utr，4：inhibitor control；psiCHECK－utr，5：miR－323；psiCHECK－utr，6：miR－323inhibitor；psiCHECK－utr，7：miR－105－1；psiCHECK－utr，8：miR－105－1inhibitor；psiCHECK－utr，9：miR－323；miR－105－1；psiCHECK－utr，10：miR－323inhibitor；miR－105－1inhibitor；psiCHECK－utr。轉(zhuǎn)染后分別于24、36、48h進(jìn)行雙熒光素酶活性檢測。

1.7 轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的雙熒光素酶活性檢測 將轉(zhuǎn)染完成后細(xì)胞培養(yǎng)板中的培養(yǎng)液棄去，按照雙熒光素酶檢測試劑盒說明，用微孔板發(fā)光分析儀檢測螢火蟲熒光素酶（firefly luciferase）和海參熒光素酶（renilla luciferase）活性。

2 結(jié)果

2.1 psiCHECK－utr重組載體的鑒定 將構(gòu)建好的psiCHECK－utr重組載體做PCR鑒定和PmeⅠ／XhoⅠ雙酶切鑒定，均得到了大小157bp的目的條帶（圖1），測序結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)序列一致，psiCHECK－utr重組載體構(gòu)建成功。

圖1 psiCHECK－utr重組載體的雙酶切和PCR鑒定

2.2 生物信息學(xué)預(yù)測與PRRSV相關(guān)的miRNAs

結(jié)合 Mirnada、RNAhybrid和RNA22三個(gè)靶標(biāo)預(yù)測軟件，篩選到3條潛在的豬miRNAs：ssc－miR－323、ssc－miR－105－1、ssc－miR－105－2，由 于 ssc－miR－105－1和ssc－miR－105－2同源，只有3′末端兩個(gè)堿基互換，選取其中的ssc－miR－105－1進(jìn)行本次試驗(yàn)。

2.3 雙熒光素酶檢測結(jié)果

2.3.1 psiCHECK－utr受SUVEC細(xì)胞作用影響

轉(zhuǎn)染psiCHECK－utr和psiCHECKTM－2空載體對照的SUVEC細(xì)胞，雙熒光素酶試劑檢測發(fā)現(xiàn)，psi－CHECK－utr發(fā)光比率相比對照組在24、36、48h都略有上升，48h時(shí)最明顯（圖2），說明SUVEC細(xì)胞對PRRSV 3′utr表達(dá)沒有抑制效果，進(jìn)行t檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，3組產(chǎn)生的變化差異都不顯著，可能說明細(xì)胞中相關(guān)miRNA對PRRSV 3′utr沒有抑制作用，而且某些未知因素有利于PRRSV 3′utr的表達(dá)。

2.3.2 psiCHECK－utr與 ssc－miR－323、ssc－miR－105－1共轉(zhuǎn)染細(xì)胞雙熒光素酶檢測 重組載體psi－CHECK－utr分別與ssc－miR－323、ssc－miR－105－1以及兩者混合物共轉(zhuǎn)染SUVEC，設(shè)置miRNA Control做對照，36h、48h后檢測（圖3），可以看到psi－CHECK－utr與ssc－miR－105－1共轉(zhuǎn)染組以及與兩個(gè)miRNAs的混合共轉(zhuǎn)染組熒光比率在36h和48h較對照組都有所下降，48h時(shí)變化更明顯，抑制率可以達(dá)到 30%，而 psiCHECK－utr與ssc－miR－323共轉(zhuǎn)染組熒光比率較對照組沒有下降，說明sscmiR－105－1可能對PRRSV 3′utr有一定抑制的作用，不過差異顯著性檢驗(yàn)并沒有發(fā)現(xiàn)試驗(yàn)組與對照組之間有顯著性差異。

圖2 psiCHECK－utr轉(zhuǎn)染SUVEC細(xì)胞后雙熒光素酶相對活性比較

圖3 psiCHECK－utr與ssc－miR－323、ssc－miR－105－1共轉(zhuǎn)染細(xì)胞雙熒光素酶相對活性比較

2.3.3 psiCHECK－utr與 ssc－miR－323、ssc－miR－105－1抑制物共轉(zhuǎn)染細(xì)胞雙熒光素酶檢測 重組載體 psiCHECK－utr 分 別 與 ssc－miR－323、ssc－miR－105－1的抑制物以及兩者的混合物共轉(zhuǎn)染SUVEC細(xì)胞系，同時(shí)設(shè)置inhibitor control做對照，36h、48 h后，雙熒光素酶試劑檢測（圖4），柱狀圖看到，加入miRNA抑制物的各試驗(yàn)組比對照組略有下降，但差異不明顯。

2.3.4 ssc－miR－323、ssc－miR－105－1 對 PRRSV 3′utr表達(dá)的影響 分別分析ssc－miR－323和sscmiR－105－1對 PRRSV 3′utr抑 制 作 用，設(shè) 置 psi－CHECK－utr單獨(dú)轉(zhuǎn)染做對照（圖5），發(fā)現(xiàn)ssc－miR－323轉(zhuǎn)染后，雙熒光素酶發(fā)光比率略有上升，與2.3.1中psiCHECK－utr轉(zhuǎn)染SUVEC后熒光比率上升情況相同，說明ssc－miR－323對 PRRSV 3′utr表達(dá)沒有抑制作用；而轉(zhuǎn)染ssc－miR－105－1后，發(fā)光比率有所下降，36h和48h抑制率都在13%左右，而轉(zhuǎn)染ssc－miR－105－1抑制物后，發(fā)光比率恢復(fù)，說明sscmiR－105－1對PRRSV 3′utr表達(dá)是有抑制作用的。

圖4 psiCHECK－utr與ssc－miR－323、ssc－miR－105－1抑制物共轉(zhuǎn)染細(xì)胞雙熒光素酶相對活性比較

圖5 ssc－miR－323和ssc－miR－105－1對PRRSV 3′utr抑制作用的雙熒光素酶相對活性檢測

3 討論

已經(jīng)有大量研究證明，細(xì)胞miRNA可以對病毒起到調(diào)節(jié)作用［2］，miRNA與PRRSV的研究有助于為PRRSV防控帶來新的機(jī)遇，雙熒光素酶報(bào)告基因是目前國際上通用的對miRNA及靶標(biāo)進(jìn)行驗(yàn)證的工具載體［3］。

本試驗(yàn)對計(jì)算機(jī)預(yù)測［4］到的3條豬miRNAs進(jìn)行驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)了一些現(xiàn)象，首先psiCHECK－utr載體轉(zhuǎn)染SUVEC細(xì)胞后，熒光比率沒有下降，反而上升，說明PRRSV 3′utr表達(dá)沒有被抑制，暗示細(xì)胞系自身的miRNAs對PRRSV 3′utr表達(dá)不具有抑制作 用。而在轉(zhuǎn)染 ssc－miR－323 和 ssc－miR－105－1抑制物的試驗(yàn)組中，發(fā)現(xiàn)PRRSV 3′utr表達(dá)反而略受抑制，這或許說明細(xì)胞中能與PRRSV 3′utr作用的miRNAs被某些因素抑制了。在ssc－miR－323共轉(zhuǎn)組中，發(fā)現(xiàn)PRRSV 3′utr表達(dá)不但沒有抑制，相反略有上升，與psiCHECK－utr單獨(dú)轉(zhuǎn)染SUVEC結(jié)果相同，說明ssc－miR－323對 PRRSV 3′utr并沒有抑制作用。而在ssc－miR－105－1的轉(zhuǎn)染組中，發(fā)現(xiàn)PRRSV 3′utr有一定抑制，而且ssc－miR－323和sscmiR－105－1混合轉(zhuǎn)染組結(jié)果也證實(shí)了這一點(diǎn)，但是抑制效果并不明顯，抑制率只有13%～30%。同時(shí)，進(jìn)行 PRRSV 3′utr BLAST 比對后，發(fā)現(xiàn)PRRSV 3′utr具有極高的保守性，已知的PRRSV所有毒株保守性都高達(dá)94%以上。推測可能也正是PRRSV針對宿主miRNA長期篩選進(jìn)化的結(jié)果，使得病毒3′utr能夠逃避宿主miRNA的抑制，得以在宿主細(xì)胞中持續(xù)感染和長期存活。

［1］Meng X J.Heterogeneity of porcine reproductive and respiratory syndrome virus：implications for current vaccine efficacy and future vaccine development［J］.Vet Microbiol，2000，74（4）：309－329.

［2］Sung T L，Rice A P.MiR－198Inhibits HIV－1Gene Expression and Replication in Monocytes and Its Mechanism of Action Appears To Involve Repression of Cyclin T1［J］.PLoS Pathogens，2009，2（5）：1－13.

［3］侯勃，張彥明，朱曉娟，等.豬血管內(nèi)皮細(xì)胞中與豬瘟病毒相關(guān)microRNA的初步篩選［J］.畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2010，41（5）：576－580.

［4］Peng X X，Chan E Y，Li Y，etal.Virus－h(huán)ost interactions：from systems biology to translational research［J］.Current Opinion in Microbiology，2009，7（12）：432－438.