何彥峰，楊仁明，胡 娜，索有瑞，王洪倫*

1中國(guó)科學(xué)院西北高原生物研究所，西寧810001;2中國(guó)科學(xué)院研究生院，北京100049

響應(yīng)面法優(yōu)化胡蘆巴種子多糖提取工藝

何彥峰1，2，楊仁明1，2，胡 娜1，2，索有瑞1，王洪倫1*

1中國(guó)科學(xué)院西北高原生物研究所，西寧810001;2中國(guó)科學(xué)院研究生院，北京100049

利用單因素實(shí)驗(yàn)及響應(yīng)面法優(yōu)化確定胡蘆巴種子多糖的提取工藝。通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)篩選出料液比、提取時(shí)間、提取溫度三個(gè)主要因素，以胡蘆巴種子多糖提取得率為響應(yīng)值進(jìn)行Box-Behnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)，建立胡蘆巴種子多糖提取得率的二次回歸方程，得到優(yōu)化組合條件。響應(yīng)面法分析結(jié)果表明，當(dāng)料液比為1∶28 (g:mL)，提取時(shí)間1.2 h，提取溫度85℃時(shí)驗(yàn)證優(yōu)化工藝得胡蘆巴種子多糖最大提取得率19.89%，接近于模型預(yù)測(cè)值20.24%。

胡蘆巴;多糖;響應(yīng)面法;提取工藝

胡蘆巴(Trigonella foenum-graecum L.)，又名苦豆、香豆，豆科一年生草本植物，是一種集藥用、食用、香料和飼料等價(jià)值于一身的經(jīng)濟(jì)作物。研究表明其主要含有甾體皂苷類、多糖類、氨基酸、生物堿、黃酮類等化學(xué)成分。胡蘆巴作為中藥具有溫腎助陽(yáng)、催乳、健胃、驅(qū)寒止痛等功效［1，2］。近期研究表明，胡蘆巴具有降血糖和降血脂功能而被用來(lái)治療糖尿病、心腦血管疾病，并具保肝護(hù)肝的功能和抗氧化特性，其主要活性成分為胡蘆巴多糖［3-6］。同時(shí)，由于胡蘆巴多糖具有使食物增稠成型，保持食品色、香、味、結(jié)構(gòu)和食品的相對(duì)穩(wěn)定性等特性而廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)，并于1999年6月通過(guò)全國(guó)食品添加劑標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)委員會(huì)第二十次年會(huì)的新品種審批，成為一種新的的增稠劑［7］。因此，研究和優(yōu)化胡蘆巴多糖提取工藝對(duì)開(kāi)發(fā)和利用胡蘆巴資源有重要意義。

本研究在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上選擇料液比、提取時(shí)間、提取溫度3個(gè)主要因素，用苯酚-硫酸法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，以多糖提取得率為依據(jù)，采用響應(yīng)面法對(duì)青海產(chǎn)胡蘆巴種子多糖提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化。以期為研究胡蘆巴種子多糖的提取工藝路線提供參考，為胡蘆巴資源的開(kāi)發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

胡蘆巴種子2010年8月采自青海省大通縣，由中國(guó)科學(xué)院西北高原生物研究所周昌范高級(jí)工程師鑒定;石油醚、三氯甲烷、正丁醇、無(wú)水乙醇、濃硫酸、苯酚和葡萄糖均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

DFY1000C高速萬(wàn)能粉碎機(jī)，溫嶺市林大機(jī)械有限公司;101-1ES電熱鼓風(fēng)干燥箱，北京市永光明醫(yī)療儀器廠;優(yōu)普UPT系列超純水器，成都超純科技有限公司;HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋，國(guó)華電器有限公司;UV-759紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海精密科學(xué)儀器有限公司;ALC-110.4型電子天平，德國(guó)Acculab公司。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作、多糖含量測(cè)定［8，9］

精確稱取105℃下干燥至恒重的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品0.1 g，純水定容至1000 mL。精密吸取0.1 g/L的葡萄糖對(duì)照品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，分別置于10 mL試管中，依次加純水使最終體積為2 mL，然后分別加入5%的苯酚1 mL，迅速加入濃硫酸5 mL，靜置10 min，混勻放入30℃水浴加熱20 min，取出冷卻至室溫，用2 mL純水做空白，于490 nm波長(zhǎng)處測(cè)樣品的吸光度(A)，以多糖濃度(C，g/ mL)為橫坐標(biāo)，吸光度值(A)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。用最小二乘法計(jì)算得到回歸方程A=0.0102C +0.0815(r=0.9993)。

1.3.2 胡蘆巴種子多糖的提取與含量測(cè)定

取300 g干燥的胡蘆巴種子，用高速萬(wàn)能粉碎機(jī)粉碎，過(guò)0.25 mm篩，使用石油醚索氏提取3次，每次2 h，揮干石油醚后在干燥箱中30℃烘干，備用。精確稱取處理好的胡蘆巴種子粉末1.0 g置于250 mL圓底燒瓶中，按照一定的料液比、提取溫度、提取時(shí)間和提取次數(shù)進(jìn)行加熱回流提取，提取完成后3500 rpm離心15 min，上清液用sevage法除蛋白3次，再用3倍體積95%乙醇4℃沉淀24 h，然后將沉淀溶解定容至100 mL容量瓶，按照1.3.1中的步驟測(cè)定多糖的吸光度，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算種子多糖含量，并以下式計(jì)算提取得率:

多糖提取得率(%)=(胡蘆巴種子多糖含量/胡蘆巴種子質(zhì)量)×100%

1.4 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與數(shù)據(jù)分析方法

1.4.1 單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

在進(jìn)行響應(yīng)面分析之前，先通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)選出對(duì)胡蘆巴種子多糖提取得率具顯著影響的因素，并確定其試驗(yàn)水平。參考相關(guān)文獻(xiàn)，本文稱取1.0 g胡蘆巴種子，考查了不同的料液比(1∶15～1∶35)、提取溫度(50℃ ～90℃)、提取時(shí)間(0.5 h～2.5 h)和提取次數(shù)(1～4次)對(duì)胡蘆巴種子多糖提取得率的影響。

1.4.2 響應(yīng)面法實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與數(shù)據(jù)分析方法

根據(jù)Box-Benhnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，選擇影響胡蘆巴種子多糖提取得率(Y)的3個(gè)主要影響因素:料液比(X1)、提取時(shí)間(X2)、提取溫度(X3)進(jìn)行組合。以-1、0、1代表自變量水平，xi為自變量的編碼值;Xi為自變量的真實(shí)值;其關(guān)系為xi=(Xi－X0)/ ΔX。其中，X0為試驗(yàn)中心點(diǎn)處自變量的真實(shí)值;ΔX為自變量的變化步長(zhǎng)［10］。試驗(yàn)因素及水平編碼見(jiàn)表1，具體實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案見(jiàn)表2。

表1 Box-Behnken設(shè)計(jì)因素水平及編碼Table 1 Factors and levels in Box-Behnken design

采用Design expert 8.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，擬合二次多項(xiàng)式方程。多項(xiàng)式模型方程擬合可靠性由R2表達(dá)，R2越接近于1，則多項(xiàng)式模型與實(shí)際擬合可靠性越高;其統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著性由F值檢驗(yàn)，F(xiàn)值越大表明該變量對(duì)因變量的影響越顯著;因素的線性效應(yīng)、平方效應(yīng)及其交互效應(yīng)的顯著性由模型系數(shù)的P值檢驗(yàn)，概率P值越小，則相應(yīng)變量的顯著程度越高，P＜0.01時(shí)影響為極顯著，P＜0.05影響顯著［11］。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 料液比對(duì)多糖提取得率的影響

設(shè)定提取溫度為80℃，提取時(shí)間為1.5 h條件下，以料液比對(duì)多糖提取得率做單因素試驗(yàn)。設(shè)計(jì)料液比為1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35。結(jié)果表明，多糖提取得率隨料液比的增加而呈上升趨勢(shì)，但料液比在1∶25之后多糖提取得率增長(zhǎng)緩慢。從成本和時(shí)間方面考慮，料液比選擇在1∶25～1∶30之間為宜。

2.1.2 提取溫度對(duì)多糖提取得率的影響

設(shè)定提取時(shí)間為1.5 h，料液比為1∶25條件下，以提取溫度對(duì)多糖提取得率做單因素試驗(yàn)。設(shè)計(jì)提取溫度為50、60、70、80、90℃。結(jié)果表明，在小于80℃時(shí)，隨著溫度的升高，多糖提取得率逐漸增加，且增幅明顯，80℃時(shí)達(dá)到最大，之后略顯下降。這一趨勢(shì)可能是由于溫度過(guò)高，胡蘆巴多糖的結(jié)構(gòu)被破壞，使其得率下降。因此選擇溫度為80℃左右為宜。

2.1.3 提取時(shí)間對(duì)多糖提取得率的影響

設(shè)定提取溫度為80℃，料液比為1∶25條件下，以提取時(shí)間對(duì)多糖提取得率做單因素試驗(yàn)。設(shè)計(jì)提取時(shí)間0.5、1、1.5、2、2.5 h。結(jié)果表明，多糖得率隨時(shí)間的增長(zhǎng)呈上升趨勢(shì)，1.5 h附近達(dá)到最大，之后趨于平緩，為減少能耗，節(jié)約時(shí)間，提取時(shí)間選擇1.5 h為宜。

2.1.4 提取次數(shù)對(duì)多糖提取得率的影響

設(shè)定提取溫度80℃，料液比1∶25(g:mL)，提取時(shí)間1.5 h條件下，以提取次數(shù)對(duì)多糖提取得率做單因素試驗(yàn)。結(jié)果表明，提取兩次后多糖提取得率基本保持不變，考慮到生產(chǎn)效率，選擇提取兩次為宜。

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化胡蘆巴種子多糖提取工藝

2.2.1 響應(yīng)面分析方案與結(jié)果

對(duì)胡蘆巴種子多糖提取工藝進(jìn)行響應(yīng)面分析，其具體試驗(yàn)方案及結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 多糖提取工藝條件的優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Optimization of extraction conditions and results of experimental design

表3 方差分析結(jié)果Table 3 ANOVA of regression analysis

采用Design-Expert8.0軟件對(duì)各因素進(jìn)行回歸擬合，得回歸方程方程:多糖提取得率=19.47+ 1.43×X1+0.86×X2+1.65×X3-0.87×X1X2-0.84 ×X1X3-0.67×X2X3-1.13×-1.39×-1.64×

由表3可知，方程中除X2X3(時(shí)間和溫度兩因素的交互作用)無(wú)顯著影響外，三因素的其它交互項(xiàng)、線性及其平方項(xiàng)對(duì)多糖提取得率均達(dá)到極顯著水平(P＜0.01)，三因素與響應(yīng)值之間線性關(guān)系極為顯著;R2=0.985表明該二次回歸得到的多糖提取得率模型與實(shí)際擬合較好，符合度為98.50%，表明使用該方程模擬實(shí)際的三因素三水平分析是可行的。同時(shí)，由F值的大小可以推斷，在所選擇的試驗(yàn)范圍內(nèi)，3個(gè)因素對(duì)多糖提取得率影響的排序?yàn)樘崛囟?X3)＞料液比(X1)＞提取時(shí)間(X2)。

2.2.2 因素間的交互影響

根據(jù)擬合模型繪制胡蘆巴種子多糖的響應(yīng)面的三維圖與等高線，可直觀地看出響應(yīng)面的最高點(diǎn)，即參數(shù)范圍內(nèi)的極值以及因素間的相互作用對(duì)響應(yīng)值的影響，依次可以確定最佳工藝參數(shù)范圍。Design-Expert8.0軟件處理后三維響應(yīng)面和等高線圖見(jiàn)圖1～3。

圖1 Y=f(X1，X2)的響應(yīng)面與等高線Fig.1 Responsive surfaces and contours of Y=f(X1，X2)

圖1為提取溫度為80℃時(shí)不同提取時(shí)間和料液比對(duì)胡蘆巴種子多糖提取得率的影響，從圖中可知，在提取時(shí)間較長(zhǎng)，料液比較大的范圍內(nèi)可以達(dá)到響應(yīng)值的最高點(diǎn)。

圖2為提取時(shí)間為1 h時(shí)不同提取溫度和料液比對(duì)胡蘆巴種子多糖提取得率的影響。從圖中可知，提取溫度和料液比較低時(shí)，多糖提取得率較低，但提取溫度過(guò)高，料液比較大時(shí)也會(huì)導(dǎo)致多糖的提取得率下降，這可能是由于溫度過(guò)高會(huì)破壞多糖結(jié)構(gòu)致使多糖檢測(cè)量下降。

圖3為料液比為1∶25時(shí)不同提取時(shí)間和提取溫度對(duì)胡蘆巴種子多糖提取得率的影響，從圖中可知，在長(zhǎng)時(shí)高溫的提取條件下，樣品中的雜質(zhì)會(huì)伴隨多糖一起被提出來(lái)，從而導(dǎo)致多糖提取得率的下降。

總的來(lái)看，提取溫度對(duì)多糖提取得率的影響最為顯著，在所選溫度范圍內(nèi)，隨著提取溫度的不斷增高，多糖的提取得率也隨之增大，表現(xiàn)為曲面較陡，而提取時(shí)間和料液比的影響次之，曲面較平緩。

2.3 胡蘆巴種子多糖提取工藝條件的確定

通過(guò)軟件Design-Expert 8.0求解方程，得出了最優(yōu)提取工藝條件為:料液比為1:28.28，提取時(shí)間為1.16 h，提取溫度為84.85℃，胡蘆巴種子多糖的提取得率可達(dá)20.24%。考慮到實(shí)際操作的可行性，同時(shí)又達(dá)到節(jié)省時(shí)間與能耗并取得最佳效果的目的，將胡蘆巴種子多糖的提取工藝條件修正為:料液比1∶28，提取時(shí)間為1.7 h，提取溫度85℃。

按上述最佳工藝即料液比1∶28，提取時(shí)間為1.2 h，提取溫度85℃提取胡蘆巴種子多糖(n=3)以驗(yàn)證響應(yīng)面法的可行性。結(jié)果，平均提取得率為19.89%，與預(yù)測(cè)值20.24%比較，基本吻合，比單因素平均提取率高4.87%。

3 結(jié)論

本文在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面法對(duì)胡蘆巴種子多糖提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化。通過(guò)回歸方程優(yōu)化得胡蘆巴種子多糖的最佳提取工藝為:料液比1∶28，提取時(shí)間為1.2 h，提取溫度85℃，此條件下胡蘆巴種子多糖平均提取得率為19.89%?；貧w分析和驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果表明，采用響應(yīng)面法優(yōu)化胡蘆巴種子多糖的提取工藝條件，得到的多糖提取工藝流程具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

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Optimization of Extraction Process of Polysaccharides from Fenugreek (Trigonella foenum-graecum L.)by Response Surface Methodology

HE Yan-feng1，2，YANG Ren-ming1，2，HU Na1，2，SUO You-rui1，WANG Hong-lun1*
1.Northwest Institute of Plateau Biology，Chinese Academy of Sciences，Xining 810001，China; 2.Graduate School of the Chinese Academy of Sciences，Beijing，100049，China

Single-factor tests and response surface method(RSM)were used to optimize the extraction process of fenugreek seed polysaccharides(FSP).In order to obtaining the maximum of extraction yield of the polysaccharides，three main factors including extraction temperature，extraction times and ratio of raw material to water were selected with the Box-Behnken design and a quadric regression equation for predicting the yield of polysaccharides was established.The results showed that the optimum extraction conditions were as follows:extraction temperature 85℃，extraction times 1.2 h，and ratio of raw material to water 1∶28.Under the conditions，the optimum extracting yield of FSP was 19.89%，which is well matched with the predictive extracting yield 20.24%.

fenugreek;polysaccharides;response surface methodology;extraction process

1001-6880(2012)10-1463-05

2012-01-04 接受日期:2012-03-29

中國(guó)科學(xué)院生命科學(xué)領(lǐng)域優(yōu)秀青年科技專項(xiàng)(KSCX2-EW-Q-23)

*通訊作者 Tel:86-971-6143857;E-mail:hlwang@nwipb.cas.cn

TS255.36

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