史琳婧，楊世仙，畢峻龍，尹革芬*，王躍虎

1中南大學(xué)藥學(xué)院，長沙410078;2中國科學(xué)院昆明植物研究所資源植物與生物技術(shù)所級重點實驗室; 3云南農(nóng)業(yè)大學(xué)園林園藝學(xué)院;4云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，昆明650201

蠟梅枝葉化學(xué)成分及其抗病毒活性

史琳婧1，2，楊世仙2，3，畢峻龍4，尹革芬4*，王躍虎2*

1中南大學(xué)藥學(xué)院，長沙410078;2中國科學(xué)院昆明植物研究所資源植物與生物技術(shù)所級重點實驗室;3云南農(nóng)業(yè)大學(xué)園林園藝學(xué)院;4云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，昆明650201

利用各種色譜技術(shù)從蠟梅枝葉中共分離得到10個化合物，通過波譜學(xué)方法將其鑒定為(+)-Calycanthine(1)、(-)-Folicanthine(2)、(-)-Chimonanthine(3)、異秦皮啶(4)、3，3'-雙異秦皮啶(5)、Euoniside(6)、山奈酚-3-O-蕓香糖苷(7)、3，4-二羥基苯乙腈(8)、Di-O-methylcrenatin(9)和Acanthoside B(10)。化合物4～10為首次從該植物中發(fā)現(xiàn)。采用細胞病變效應(yīng)法測試了化合物1～5與8對豬繁殖與呼吸綜合征病毒的抑制活性，化合物2(IC50=58.9±10.2 μM;TI=19.3)、3(IC50=68.9±3.1 μM;TI=17.9)與8(IC50=80.5±16.9 μM;TI＞19.9)顯示出了弱的抑制活性。

蠟梅科;蠟梅;生物堿;豬繁殖與呼吸綜合征病毒

蠟梅(Chimonanthus praecox Link)是蠟梅科(Calycanthaceae)蠟梅屬落葉灌木或小喬木，主要分布于我國南方，是傳統(tǒng)庭院名花和園林綠化植物。其根、葉可藥用，用于治療跌打、腰痛、風濕麻木、風寒感冒等。其花亦用于治療頭暈、胸悶、梅核氣、咽喉腫痛、百日咳、小兒麻診等。果實有健脾止瀉功效，常用于治療腹瀉久痢等癥［1］。前人對其根、果實、葉和花的化學(xué)成分進行過研究，發(fā)現(xiàn)了色胺來源的生物堿、花青素、黃酮醇、倍半萜及其糖苷以及苯丙素糖苷等［2-7］。其中生物堿(+)-Calycanthine和(-)-Folicanthine有抗真菌活性［6］，(-)-Chimonanthine、(-)-Calycanthidine和(-)-Folicanthine有細胞毒活性［7］。為了從天然產(chǎn)物中篩選動物病毒抑制劑［8］，我們對蠟梅枝葉的化學(xué)成分進行了研究，并測試了分離物對豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)的抑制活性。

1 儀器與材料

旋光通過JASCO DIP-370型數(shù)字式旋光儀測定;NMR在Bruker AM-400和DRX-500核磁共振儀上測量(TMS為內(nèi)標);FAB-MS由VG Auto Spec-3000質(zhì)譜儀測定;ESI-MS由API Qstar Pulsar1質(zhì)譜儀測定;Sephadex LH-20是GE Healthcare Bio-Sciences AB產(chǎn)品;D101大孔樹脂、硅膠GF254與柱層析用硅膠G(80～100目，300～400目)為青島美高集團有限公司的產(chǎn)品;C-18反相硅膠(40～75 μm)來自美國的Fuji Silysia Chemical LTD的產(chǎn)品;高效液相色譜儀為Agilent 1200(色譜柱Zorbax SB-C18，9.4 (250 mm，5 μm);旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀是BUCHI公司的Rotavapor RII。

植物材料于2009年8月采自云南省昆明市，經(jīng)中國科學(xué)院昆明植物研究所胡光萬博士鑒定為蠟梅(Chimonanthus praecox)。

2 提取與分離

蠟梅枝、葉(3.6 kg)干燥、粉碎，用甲醇回流提取3次(4、3、3 h)，濃縮后得浸膏，加適量水混懸，石油醚萃取(棄)，無機相用1%HCl調(diào)pH值至1，乙酸乙酯萃取(棄)。無機相用5%NaOH調(diào)pH值至10，用氯仿萃取。氯仿萃取物部分(5 g)用中壓反相硅膠層析，50%甲醇洗脫部分經(jīng) Sephadex LH-20 (MeOH)和制備性TLC(氯仿-甲醇-二乙胺，5∶1∶0.05)分離得到化合物1(11.2 mg)和3(87.7 mg);70%～80% 甲醇洗脫部分合并經(jīng) Sephadex LH-20 (MeOH)和制備性TLC(氯仿-甲醇-二乙胺，5∶1∶0.05)得到化合物2(35.2 mg)。

氯仿萃取后的無機相用1%HCl調(diào)pH值至7，D101大孔樹脂柱層析分離，分別用水與95%乙醇洗脫。取95%乙醇部分經(jīng)硅膠柱層析，用氯仿-甲醇梯度洗脫。氯仿-甲醇(5∶1)洗脫部分經(jīng)中壓反相硅膠柱層析，10%～30%甲醇洗脫部分用Sephadex LH-20(MeOH)和制備性TLC分離得到化合物8 (18.6 mg;氯仿-甲醇，5∶1)和9(13.4 mg;氯仿-甲醇，3∶1);40%～50%甲醇洗脫部分用Sephadex LH-20(MeOH)和硅膠柱色譜(氯仿-甲醇，5∶1)分離得到化合物4(18.0 mg);60%甲醇洗脫部分經(jīng)Sephadex LH-20(MeOH)柱層析后得到化合物5(20.8 mg)。氯仿-甲醇(2∶1)洗脫部分經(jīng)中壓反相硅膠柱層析，20% 甲醇洗脫部分用 Sephadex LH-20 (MeOH)柱層析后重結(jié)晶得到化合物6(14.1 mg); 40% ～50% 甲醇洗脫部分用 Sephadex LH-20 (MeOH)和制備性TLC分離得到化合物7(28.7 mg;氯仿-甲醇，3∶1)和10(17.8 mg;氯仿-甲醇，5∶1)。

3 生物活性測定

3.1 細胞系與病毒

Marc-145細胞(中國科學(xué)院上海細胞庫)用含有10%胎牛血清(Fetal bovine serum，F(xiàn)BS;HyClone Co.)，100 U/mL青霉素，和100 μg/mL鏈霉素的營養(yǎng)液在37℃，5%CO2的培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。待細胞長至單層時，使用0.25%胰酶(HyClone Co.)進行消化，根據(jù)實驗的需要轉(zhuǎn)入96孔培養(yǎng)板進行培養(yǎng)。本實驗所使用的PRRSV(YN-1株)在云南分離獲得［9］。該毒株在Marc-145細胞上的半數(shù)感染量(50%Tissue culture infectious dose，TCID50)為10-5.3TCID50/0.1 mL。

3.2 化合物細胞毒性測定

化合物對Marc-145細胞的毒性使用WST-8方法進行測定［10］。簡單來說，將密度為1×104cells/ mL的Marc-145 cells加入96孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)至單層，將化合物1～5和8以及陽性對照磷酸替米考星(湖北恒碩生物化工有限公司)用DMEM培養(yǎng)液(Dulbecco’s modified Eagle’s medium，HyClone Co.)做2倍連續(xù)稀釋，每個梯度濃度接種3個細胞孔，混合液總量為100 μl。同時設(shè)正常細胞對照、培養(yǎng)液對照。37℃二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d后，每孔加入10 μl CCK-8溶液(Cell Counting Kit-8，Beyotime Co.)，在細胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育1.5 h，酶標儀(Bio-Tek ELx 800)在450 nm處閱讀OD值。根據(jù)OD值計算細胞存活率及 50%細胞毒性濃度(CC50)。

3.3 抗病毒活性實驗

化合物抗病毒活性使用CPE抑制實驗進行評價［11］。將Macr-145細胞接種于96孔培養(yǎng)板中，使之長滿單層;將測試化合物分別做2倍連續(xù)稀釋，將不同濃度提取物及陽性藥物分別與500 TCID50/0.1 mL病毒液混合，然后將病毒藥物混合液加入細胞中，同時設(shè)正常細胞對照組(不含藥物和病毒)，病毒對照組(只含病毒)。于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，逐日觀察CPE，在顯微鏡下可見細胞出現(xiàn)圓縮，聚集，最后脫落。4 d后根據(jù)CPE結(jié)果判訂藥物有效抑制50%細胞出現(xiàn)病變的濃度(50%inhibition concentration，IC50)，并計算藥物治療指數(shù)(TI= CC50/IC50)。

3.4 熒光定量RT-PCR檢測PRRSV mRNA表達的變化

應(yīng)用RT-PCR方法檢測了化合物2、3和8(設(shè)4個濃度)對PRRSV ORF7和NSP9基因mRNA表達的影響［12］。給藥培養(yǎng)4 d后，使用RNA提取試劑RNAisoTM Plus(TaKaRa Biotechnology，中國大連)，按照說明書提取藥物組和病毒對照組的總RNA，所提取RNA使用30 μl RNase-free水溶解，待RNA完全溶解后于(80℃保存。所使用引物根據(jù)GenBank參考序列 PRU87392，利用Primer5.0和 Oligo6軟件，在PRRSV ORF7和NSP9保守區(qū)域分別設(shè)計了一段長為330 bp和162 bp的引物。ORF7引物序列為:上游5'-AATGGCCAGCCAGTCAATCA-3'和下游5'-TCATGCTGAGGGTGATGCTG-3'。NSP9引物序列為:上游5'-CACTAAAGAGGAAGTCGCACTCA-3'和下游 5'-GGTATGTCTCCAAACCTTGTATTCTG-3'。內(nèi)參基因beta-actin，引物序列為:上游引物5'-ATCCAGGCTGTGCTGTCC-3'，下游引物 5'-GAGGATCTTCATGAGGTAGTCG-3'。

將所提取總RNA使用PrimeScript RT? Reagent Kit(TaKaRa)反轉(zhuǎn)錄為CDNA，反應(yīng)體系為10 μL，其中RNase Free dH2O 4.5 μL，5×PrimeScript Buffer 2 μL，PrimeScript RT Enzyme MixⅠ0.5 μL，Random 6 mers(100 μM)0.5 μL，Oligo dT Primer (50 μM)0.5 μL，總RNA 2 μL。反應(yīng)程序為:37℃，15 min;85℃，5 sec。PCR反應(yīng)體系為25 μL，其中SYBR～Primix Ex TaqTMII(TaKaRa)12.5 μL，PCR Forward Primer(10 μM)0.5 μL，PCR Reverse Primer(10 μM)0.5 μL，dH2O 9.5 μL，cDNA 2 μL。使用iQ5 real time PCR儀(Bio-Rad.Co.Ltd.)進行擴增反應(yīng)程序為:1個循環(huán)(95℃，30 sec)，然后40個循環(huán)(95℃，5 sec;60℃，30 sec)。

3.5 統(tǒng)計分析

所有的實驗進行三個重復(fù)，數(shù)據(jù)使用平均值 ±標準差(SD)表示。數(shù)據(jù)分析使用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行分析，*表示差異極其顯著(P＜0.001)。

4 結(jié)構(gòu)鑒定與生物活性篩選結(jié)果

從蠟梅枝葉甲醇提取物中共分離得到10個化合物(部分化合物結(jié)構(gòu)式見圖1)，通過與文獻對比波譜數(shù)據(jù)對其結(jié)構(gòu)進行了鑒定，這些化合物包括3個色胺來源的生物堿即(+)-Calycanthine(1)［6］、(-)-Folicanthine(2)［6］和(-)-Chimonanthine(3)［13］，3個香豆素類成分即異秦皮啶(4)［14］、3，3'-雙異秦皮啶(5)［15］和Euoniside(6)［16］，以及一些其它成分:山奈酚-3-O-蕓香糖苷(7)［17］，3，4-二羥基苯乙腈(8)［18］，Di-O-methylcrenatin(9)［19］和Acanthoside B(10)［20］。

圖1 化合物1～3與8的結(jié)構(gòu)Fig.1 Chemical structures of compounds 1-3 and 8

采用細胞病變效應(yīng)法(Cytopathic effect，CPE)對化合物1～5與8的對PRRSV的抑制活性進行測試，化合物2(IC50=58.9±10.2 μM;TI=19.3)、3(IC50=68.9±3.1 μM;TI=17.9)與8(IC50= 80.5±16.9 μM;TI＞19.9)顯示了弱的抑制活性(表1)。由于目前尚沒有豬繁殖與呼吸綜合征的有效治療藥物，我們選用了獸用抗生素磷酸替米考星作為陽性對照藥，其對PRRSV的抑制作用(IC50= 225.1±27.4 μM)比上述3個化合物的更弱，且治療指數(shù)(TI=3.8)較低。

表1 化合物2、3和8對Marc-145細胞感染的PRRSV病毒抑制效果Table 1 The Inhibitory Effects of 2，3 and 8 on PRRSV in Marc-145 Cells

在觀察細胞病變的同時，通過熒光定量RTPCR檢測了PRRSV mRNA表達的變化。在給藥4 d后，化合物2、3和8(濃度50～400 μM)不同程度地下調(diào)了PRRSV NSP9與ORF7基因的相對表達量(圖2)。

PRRSV病毒的RNA依賴性RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase，RdRp;nsp9)是 PRRSV病毒RNA合成的關(guān)鍵酶，由NSP9基因編碼［21］。ORF7基因則編碼N蛋白(Nucleocapsid protein N)，后者是病毒感染的細胞中含量最豐富的病毒蛋白，其功能是負責病毒粒子的組裝和去組裝［22］。NSP9和ORF7 mRNA表達的下調(diào)，表明PRRSV RNA的復(fù)制和病毒粒子的組裝可能被測試的化合物所抑制。

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Chemical Constituents from the Branches and Leaves of Chimonanthus praecox with Antiviral Activity Investigations

SHI Lin-jing1，2，YANG Shi-xian2，3，BI Jun-long4，YIN Ge-fen4*，WANG Yue-hu2*1School of Pharmaceutical Science，Central South University，Changsha 410078，China;2Key Laboratory of Economic Plants and Biotechnology，Kunming Institute of Botany，Chinese Academy of Sciences;3College of Landscape and Horticulture，Yunnan Agricultural University;4College of Animal Science and Technology，Yunnan Agricultural University，Kunming 650201，China

Ten compounds were isolated from the branches and leaves of Chimonanthus praecox by various chromatographic techniques.By spectroscopic methods，their structures were elucidated as(+)-calycanthine(1)，(-)-folicanthine(2)，(-)-chimonanthine(3)，isofraxidin(4)，3，3'-biisofraxidin(5)，euoniside(6)，kaempferol-3-O-rutinoside (7)，3，4-dihydroxybenzonitrile(8)，di-O-methylcrenatin(9)and acanthoside B(10).Among them，compounds 4-10 were obtained from the herb for the first time.The inhibitory activity of compounds 1-5 and 8 against porcine respiratory and reproductive syndrome virus(PRRSV)was measured by the cytopathic effect(CPE)method.Compounds 2(IC50=58.9±10.2 μM;TI=19.3)，3(IC50=68.9±3.1 μM;TI=17.9)and 8(IC50=80.5±16.9 μM;TI＞19.9)showed weak effect on PRRSV.

Calycanthaceae;Chimonanthus praecox;alkaloids;PRRSV

1001-6880(2012)10-1335-04

2012-02-17 接受日期:2012-04-18

國家自然科學(xué)基金項目(31160509)

*通訊作者 E-mail:yingefen383@sohu.com;wangyuehu@mail.kib.ac.cn

R284.2;Q946.91

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