張齊雄，施倫勇，劉衍季

西南大學(xué)藥學(xué)院，重慶400715

黃芩苷鑭(Ⅲ)、釔(Ⅲ)配合物的合成及生物活性研究

張齊雄*，施倫勇，劉衍季

西南大學(xué)藥學(xué)院，重慶400715

改進(jìn)以往反應(yīng)條件，合成了黃芩苷鑭(Ⅲ)、黃芩苷釔(Ⅲ)配合物，利用IR、UV、LC-MS和金屬元素含量測(cè)定對(duì)配合物進(jìn)行了表征。采用MTT法分別考察了兩種新化合物的抑菌活性(金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、沙門氏菌、白色念珠菌)和抗腫瘤活性(A549、HepG2)，采用灌胃法考察化合物對(duì)小鼠的急性毒性。結(jié)果表明:黃芩苷在與金屬配合后，結(jié)構(gòu)表征發(fā)生了一定的變化，配合物無(wú)金屬離子毒性反應(yīng)，并且其抑菌、抗腫瘤作用均顯示出黃芩苷鑭＞黃芩苷釔＞黃芩苷。

稀土金屬;黃芩苷;配合物;抗菌;抗腫瘤

稀土金屬在抗菌、抗病毒、抗腫瘤等多種生物活性方面與黃酮類化合物有相似之處［1-6］;但稀土無(wú)機(jī)鹽的毒性作用［7，8］限制了其應(yīng)用前景，故將黃酮類與稀土金屬離子配合不僅可以降低金屬離子毒性［9］，也能增強(qiáng)其活性。黃芩苷可與過(guò)渡金屬如鋅、鋁、鉻、銅等生成穩(wěn)定的配合物［10-13］，但其反應(yīng)均選擇在有機(jī)溶劑、強(qiáng)堿條件下進(jìn)行，產(chǎn)率低。改進(jìn)實(shí)驗(yàn)反應(yīng)條件，得到高產(chǎn)率的黃芩苷鑭和黃芩苷釔兩種配合物，并對(duì)其抗菌抗腫瘤活性進(jìn)行研究。

1 黃芩苷稀土金屬配合物合成及表征

1.1 儀器及試劑

黃芩苷(西安小草植物科技有限責(zé)任公司，純度大于95%，批號(hào)XC090722)，LaCl3·7H2O(分析純)、Y(NO3)3·6H2O(分析純)、EDTA(分析純)、碳酸氫鈉(分析純)，85-1恒溫磁力攪拌器(常州國(guó)華電器有限公司)，紅外光譜儀(PerkinElmer FT-IR Spectrometer Spectrum One，PerkinElmer公司)，U-1800紫外掃描儀(Hitach公司)，質(zhì)譜(Bruker HCT ESI-MS(300 MHz)Spectrometer、ABI公司)。

1.2 黃芩苷稀土金屬配合物的合成

準(zhǔn)確稱取黃芩苷3 g，加入到100 mL水中，邊攪拌邊按摩爾比1∶1逐滴加入0.565 g NaHCO3溶液，待黃芩苷完全溶解后，再分別加入不同摩爾比(3∶1、2∶1、1∶1)的LaCl3·7H2O，Y(NO3)3·6H2O溶液，30℃下攪拌反應(yīng)約2 h，分別得到帶有金屬光澤的棕黑色和棕紅色沉淀，經(jīng)過(guò)蒸餾水?dāng)?shù)遍洗滌，50℃下烘干至恒重。

1.3 結(jié)構(gòu)表征

1.3.1 產(chǎn)物金屬元素含量分析

由表1中金屬含量接近理論值可知，黃芩苷與兩種金屬以不同摩爾比反應(yīng)時(shí)，所得產(chǎn)物均為三分子黃芩苷絡(luò)合一分子金屬的結(jié)構(gòu)。

表1 黃芩苷-鑭、釔配合物的金屬含量Table 1 Metal content of baicalin complexes with La(III)、Y(III)

1.3.2 紫外圖譜分析

黃芩苷在275 nm及316 nm有兩個(gè)最大吸收峰，而配合物在275 nm的吸收峰微紅移至277 nm，316 nm波長(zhǎng)處吸收峰消失，表明發(fā)生配位后，黃芩苷結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變，又因金屬具有一定的吸電子作用，使電子躍遷所需的激發(fā)能減小及整個(gè)分子的電子離域程度增大，故而發(fā)生紅移。

1.3.3 紅外圖譜分析

黃芩苷及其稀土配合物主要基團(tuán)的紅外數(shù)據(jù)見(jiàn)表2。

表2 黃芩苷及其稀土配合物主要基團(tuán)的紅外數(shù)據(jù)(cm-1)Table 2 Position of the most important bands in IR spectra of baicalin and its complexes

推測(cè)氧的孤對(duì)電子與金屬離子的空軌道形成配位鍵后導(dǎo)致C=O的電子云密度降低，故使得配合物4位C=O的伸縮振動(dòng)吸收峰較黃芩苷紅移53 cm-1。配合物較黃芩苷5位O-H的伸縮振動(dòng)吸收峰分別紅移了約42 cm-1和35 cm-1，說(shuō)明黃芩苷的酚羥基氧也與金屬離子發(fā)生了作用。另由于金屬離子對(duì)C-O中氧的電子離域作用使得C-O的伸縮振動(dòng)吸收峰紅移了約9 cm-1和13 cm-1。綜上，黃芩苷的4位C=O和5位OH與金屬離子發(fā)生了配位。

1.3.4 質(zhì)譜分析

黃芩苷-鑭的分子離子峰為1473.8，碎片峰1297.2為分子離子斷裂失去一分子葡萄糖苷(176 Da)所得，碎片峰445.7為分子離子斷裂后所得黃芩苷(445 Da)的峰，因此，推定黃芩苷-鑭配合物由黃芩苷×3+La組成。另根據(jù)紅外結(jié)果知其在4位C=O和5位OH配位，因此，推定黃芩苷-鑭的結(jié)構(gòu)如圖1所示。

黃芩苷-釔的分子離子峰為1422.9，碎片峰1247.9為分子離子斷裂失去一分子葡萄糖苷(176 Da)所得，碎片峰893.6為分子離子斷裂失去三分子葡萄糖苷(176 Da×3)所得，因此，推定黃芩苷-釔配合物由黃芩苷×3+Y組成。另根據(jù)紅外結(jié)果知其在4位C=O和5位OH配位，因此，推定黃芩苷-釔的結(jié)構(gòu)如圖1所示。

圖1 黃芩苷-M的結(jié)構(gòu)(M=La或Y)Fig.1 Baicalin-M complex(M=La or Y)

2 黃芩苷-稀土金屬配合物生物活性

2.1 儀器、試劑及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

Thermo 6500二氧化碳培養(yǎng)箱，BioTek ELX800酶標(biāo)儀，超凈工作臺(tái)(蘇州凈化設(shè)備廠)，96孔培養(yǎng)板(Costar公司)，胎牛血清(Gibco公司)，噻唑藍(lán)(MTT)，二甲基亞砜(DMSO)，胰蛋白酶(Amresco公司)，健康昆明小鼠(體重20±2 g，購(gòu)于重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)SCXK(渝)2007-0001)。

2.2 急性毒性實(shí)驗(yàn)

將黃芩苷及黃芩苷稀土金屬配合物溶于1% NaOH溶液中(最終pH為7.1)，配成10%黃芩苷或黃芩苷稀土金屬溶液，根據(jù)最大耐受劑量法［14］，每只小鼠灌胃給予5 g·kg-1，觀察兩周，所有小鼠活動(dòng)均稍微減弱，短時(shí)間內(nèi)得到恢復(fù)，兩周后所有小鼠均未出現(xiàn)死亡，生長(zhǎng)良好。

2.3 抗菌實(shí)驗(yàn)

黃芩苷及其配合物使用1%NaOH溶解，溶液最終pH值為7.1。使用劃線法將金黃色葡萄球菌、枯草桿菌、大腸桿菌、沙門氏菌、白色念珠菌取得單個(gè)菌落并在培養(yǎng)基中培養(yǎng)后，配置菌液濃度為2× 105個(gè)∕mL，采用96孔板法倍比稀釋5個(gè)濃度(濃度∕mg·mL-1∶2、1、0.5、0.25、0.125)的化合物，每個(gè)濃度設(shè)5個(gè)復(fù)孔，再在每個(gè)孔中加入等量的菌液，細(xì)菌在培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)24 h、真菌30℃培養(yǎng)48 h后，觀察各孔是否透明，對(duì)應(yīng)化合物溶液濃度最小的透明的孔即為最小抑菌濃度MIC，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 黃芩苷及其稀土配合物的MICTable 3 The antibacterial activity of baicalin and its complexes (MIC)

2.4 抗腫瘤實(shí)驗(yàn)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的腫瘤細(xì)胞(A549、HepG2)用含10%胚牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基配成1×104個(gè)∕mL。接種于96孔板內(nèi)，每孔100 μL，置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。吸出并更換培養(yǎng)基后，待細(xì)胞長(zhǎng)至80%～90%融合時(shí)，加入不同劑量的黃芩苷及黃芩苷稀土金屬配合物溶液，使其終濃度(μM)分別20、40、80、160、320，每個(gè)濃度5個(gè)孔，每一濃度均設(shè)置溶劑對(duì)照。加藥培養(yǎng)24 h后，每孔加入MTT培養(yǎng)4 h，棄上清液后加入DMSO，振蕩并在酶標(biāo)儀中于490 nm處測(cè)定吸光度(A)值。以溶劑對(duì)照組處理的腫瘤細(xì)胞為對(duì)照組，取5個(gè)復(fù)孔的平均值，根據(jù)公式:抑制率=(1-實(shí)驗(yàn)組A值/對(duì)照組A值)×l00%計(jì)算化合物對(duì)細(xì)胞的抑制率，計(jì)算出IC50，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 黃芩苷及其配合物的抗腫瘤活性(IC50)Table 4 The antineoplastic activity of baicalin and its rare earth metal compounds(IC50)

3 討論

3.1 合成

本實(shí)驗(yàn)根據(jù)黃芩苷的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，選用等摩爾的NaHCO3溶解黃芩苷，一方面是其與黃芩苷糖元上的羧基成鹽后，水溶性大大增加，較以往文獻(xiàn)以吡啶做溶劑更為安全，產(chǎn)率提升了30%～70%左右。二是避免堿性太強(qiáng)造成與稀土元素形成沉淀，不利于配合物形成。故對(duì)于黃芩苷與其他稀土金屬配合物的合成具有參考意義。

本實(shí)驗(yàn)合成得到未見(jiàn)報(bào)道的黃芩苷-鑭，并根據(jù)對(duì)產(chǎn)物一系列表征結(jié)果確定了配合物的分子結(jié)構(gòu)。而已有報(bào)道的黃芩苷-釔用常規(guī)方法絡(luò)合比為1∶1［15］，且該報(bào)道未能合成得到除鈰、釔以外的其他黃芩苷稀土金屬配合物。本實(shí)驗(yàn)三種比例所得產(chǎn)物均為未見(jiàn)報(bào)道的絡(luò)合比為3∶1的新化合物，關(guān)于方法不同造成所得產(chǎn)物結(jié)構(gòu)不同的原因尚需進(jìn)一步研究。

本實(shí)驗(yàn)在反應(yīng)溫度和反應(yīng)時(shí)間一定的條件下，考察了黃芩苷和稀土金屬反應(yīng)摩爾比對(duì)反應(yīng)產(chǎn)率的影響，結(jié)果見(jiàn)表5

表5 黃芩苷稀土金屬配合物合成反應(yīng)的產(chǎn)率Table 5 The yield of synthesis reaction of baicalin with rare earth metal

由表5可知當(dāng)黃芩苷與稀土金屬的摩爾比為3∶1，符合反應(yīng)方程式比例時(shí)，反應(yīng)產(chǎn)率最低，說(shuō)明該反應(yīng)的平衡常數(shù)(K)值較小;而摩爾比為2∶1，即金屬較過(guò)量時(shí)，會(huì)有利于黃芩苷與其發(fā)生配合，原因可能是較高濃度的金屬離子使得K值增大，化學(xué)反應(yīng)平衡正向移動(dòng)，產(chǎn)率增高;當(dāng)摩爾比為1∶1時(shí)，反應(yīng)產(chǎn)率反而降低，可能是由于反應(yīng)體系黃芩苷濃度過(guò)低而不利于反應(yīng)進(jìn)行。其具體原因尚需研究。

3.2 生物活性

急性毒性試驗(yàn)表明黃芩苷-鑭、黃芩苷-釔對(duì)小鼠灌胃LD50＞5 g·kg-1。根據(jù)急性毒性(LD50)劑量分級(jí)，故可初步表明黃芩苷-鑭、釔配合物經(jīng)口給藥屬實(shí)際無(wú)毒范圍［14］。其毒性較低的原因可能是稀土金屬絡(luò)合后，其體內(nèi)代謝方式發(fā)生改變，加快了稀土金屬的代謝排出，體內(nèi)積累減少，使得配合物無(wú)金屬離子的毒性反應(yīng)。

由表3可知，除黃芩苷-釔對(duì)沙門氏菌的抗菌活性相比提升較小外，黃芩苷-鑭和黃芩苷-釔對(duì)上述5種菌(含革蘭氏陽(yáng)性菌、革蘭氏陰性菌、真菌)的抗菌活性均較黃芩苷提升一倍以上，表明二者為廣譜抗菌化合物，特別是黃芩苷-鑭對(duì)白色念珠菌具有良好的抑菌效果。從表4中可得到黃芩苷-鑭和黃芩苷-釔對(duì)A549和HepG2生長(zhǎng)的抑制效果明顯強(qiáng)于黃芩苷，且均為黃芩苷-鑭＞黃芩苷-釔。

合成得到的配合物的抗腫瘤作用強(qiáng)于黃芩苷，普遍認(rèn)為原因是金屬配合物可通過(guò)插入到DNA的堿基對(duì)之間，通過(guò)破壞堿基堆積力，從而影響DNA分子的內(nèi)部構(gòu)型，從而抑制DNA分子的進(jìn)一步遺傳和復(fù)制;另外配合物存在金屬，能使蛋白質(zhì)立體構(gòu)象發(fā)生變化以致蛋白質(zhì)變性，使得配合物對(duì)微生物的生長(zhǎng)抑制作用增強(qiáng);也可能是發(fā)揮了配體與金屬的協(xié)同作用。具體機(jī)制有待深入研究。

另外黃芩苷-鑭與黃芩苷-釔的其他生物活性如抗病毒、抗氧化、防治骨質(zhì)疏松癥等方面尚需進(jìn)一步研究。由此可見(jiàn)對(duì)稀土金屬黃芩苷配合物的研究對(duì)稀土金屬的醫(yī)藥開(kāi)發(fā)和傳統(tǒng)中藥的新應(yīng)用有著重要的意義。

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Research on Synthesis and Biological Activities of Baicalin-La(Ⅲ)、Y(Ⅲ)Complexes

ZHANG Qi-xiong*，SHI Lun-yong，LIU Yan-ji
College of Pharmaceutical Sciences，Southwest University，Chongqing 400715，China

Baicalin-La(Ⅲ)、Y(Ⅲ)complexes was synthesized by a new method and characterized by IR、UV、LC-MS and metal elemental analysis.Their antimicrobial activity(Staphylococcus aureus，hay-bacillus，Escherichia coli，salmonella and Candida albicans)and antitumor activity(A549 and HepG2 cells)were tested and compared with baicalin through MTT.The result indicated that the structure of baicalin-La，baicalin-Y complex has changed greatly comparing with baicalin.The acute toxicity testing of mice showed that the compounds had no metal ion toxicity.The bioactivities about antimicrobial efficacy，antitumor efficacy were best for baicalin-La，secondary for baicalin-Y and worst for baicalin.

baicalin;rare-earth metal;complexes;antibacterial;antitumor

1001-6880(2012)10-1398-04

2012-03-14 接受日期:2012-06-21

國(guó)家級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃(201210635074)

*通訊作者 E-mail:zhangqixiong@vip.qq.com

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