彭 維,吳萬征,鄒 威,朱芳繪,王永剛,王建壯,郭 靜
(1.中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,廣東 廣州 510275;2.廣東醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院,廣東 湛江 524001;3.廣東藥學(xué)院,廣東 廣州 510006;4.廣東環(huán)球制藥有限公司,廣東 佛山 528303)
紅珠膠囊是中山大學(xué)研制的中藥五類新藥,具有止咳、化痰的作用,其內(nèi)容物為化橘紅有效部位。筆者采用RRLC-ESI-MS/MS 技術(shù),首次鑒定了該藥中的9個成分,闡明了其化學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ),現(xiàn)報道如下。
Agilent 1200SL RRLC-6410QQQ液相-質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國安捷倫公司); BP211D電子分析天平(瑞士沙多利斯公司);KQ-250DE數(shù)控超聲波清洗器(昆山超聲儀器有限公司)。
柚皮苷(供含量測定用,中國藥品生物制品檢定所,批號110722-200309);新北美圣草苷(Sigma-Aldrich公司,批號:1326322,純度98.6%);野漆樹苷(Sigma-Aldrich公司,批號:023H0743,純度99.0%);橙皮內(nèi)酯水合物(云南西力生物技術(shù)有限公司提供,批號:5875-49-0-BBP00486,純度>95%);櫻桃苷(加拿大ChromaDex公司,純度>98%);7-(2″-α-鼠李糖基-6″-(3″″-羥基-3″″-甲基戊二酰)-β-D-葡萄糖基)柚皮素(自制,經(jīng)UV、IR、MS、NMR譜確證);柚皮素(Sigma公司,貨號:N5893-1g,批號:035K1316,純度97.5%)。紅珠膠囊由中山大學(xué)廣州現(xiàn)代中藥質(zhì)量研究開發(fā)中心研制,委托廣東環(huán)球制藥有限公司生產(chǎn)(批號20120501)。
甲醇(色譜純,霍尼韋爾貿(mào)易(上海)有限公司),甲酸(色譜純,美國Sigma公司),水為超純水。
2.1.1 對照品溶液的制備 分別取新北美圣草苷、櫻桃苷、柚皮苷、野漆樹苷、橙皮內(nèi)酯水合物、7-(2″-α-鼠李糖基-6″-(3″″-羥基-3″″-甲基戊二酰)-β-D-葡萄糖基)柚皮素、柚皮素對照品適量,加甲醇制成每1 mL含新北美圣草苷、櫻桃苷、柚皮苷、野漆樹苷、橙皮內(nèi)酯水合物、7-(2″-α-鼠李糖基-6″-(3″″-羥基-3″″-甲基戊二酰)-β-D-葡萄糖基)柚皮素、柚皮素各0.1 mg的混合對照品貯備液,4 ℃冷藏備用。使用時將貯備液稀釋100倍作為對照品溶液。
2.1.2 供試品溶液的制備 取裝量差異項下的膠囊內(nèi)容物,研細,取0.1 g,精密稱定,置100 mL量瓶中,加甲醇約70 mL,超聲處理(功率360 W,頻率35 kHz)30 min,放冷至室溫,用φ=50%甲醇稀釋至刻度,搖勻。取上述溶液,適當稀釋,經(jīng)0.22 μm微孔濾膜濾過,取續(xù)濾液,即得。
2.2.1 色譜條件 色譜柱:Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18(3.5 μm,150 mm×3.0 mm);柱溫30 ℃;流動相為甲醇-甲酸溶液(pH=3.0),0~50 min:甲醇(φ):30%→60%,甲酸溶液(φ):70%→40%;流速0.3 mL/min;進樣量:5 μL。
2.2.2 質(zhì)譜條件 電噴霧電離源:ESI,正、負離子模式檢測,干燥氮氣溫度350 ℃,流量12.0 L/min,霧化氣壓力40 psi,毛細管電壓4 000 V,掃描質(zhì)量范圍m/z100~1 500。
樣品在RRLC-MS/MS正模式和負模式下進行分析,結(jié)果見圖1、表1。
圖 1 紅珠膠囊正模式(A)和負模式(B)的總離子流圖Fig.1 Total Ion current of positive mode(A) and negative mode(B) of Hongzhu Capsule
通過紫外光譜特征、質(zhì)譜中分子離子峰和碎片離子峰的精確相對分子質(zhì)量匹配、保留時間對比、結(jié)合文獻查閱等信息,以及與對照品比較,確證和指認了紅珠膠囊中9個成分,具體如下。
檢測到[M+H]+準分子離子峰為m/z597.5,對其進行子離子掃描(PI),得到m/z289.1,為糖苷鍵斷裂產(chǎn)生。[M-H]-準分子離子峰為m/z595.0,對其進行子離子掃描(PI),得到m/z459.3為C環(huán)進行RDA裂解,然后丟失一個羰基產(chǎn)生;m/z287.0為糖苷鍵斷裂產(chǎn)生;m/z150.8為糖苷鍵斷裂后C環(huán)進行RDA裂解再丟失一個羰基所產(chǎn)生的。在液質(zhì)聯(lián)用中,與對照品的相對保留時間、分子離子峰和碎片離子峰的精確相對分子質(zhì)量、質(zhì)譜斷裂行為一致,經(jīng)與文獻[1-2]比對,確證該化合物為新北美圣草苷,分子式為C27H32O15。
檢測到[M+H]+準分子離子峰為m/z435.4。[M-H]-準分子離子峰為m/z433.0,對其進行子離子掃描(PI),得到m/z271.0及m/z150.7。其中m/z271.0為糖苷鍵斷裂產(chǎn)生,m/z150.7為糖苷鍵斷裂后C環(huán)進行RDA裂解,然后丟失一個H所得。在液質(zhì)聯(lián)用中,與對照品的保留時間、分子離子峰和碎片離子峰的精確相對分子質(zhì)量、質(zhì)譜斷裂行為一致,經(jīng)文獻[2-3]比對,確證該化合物為櫻桃苷,分子式為C21H22O10。
表1 紅珠膠囊化學(xué)成分分析(正模式和負模式)Table 1 Chemical Constituent Analysis in Hongzhu Capsule(positive and negative modes)
注:7-(2″-α-鼠李糖基-6″-(3″″-羥基-3″″-甲基戊二酰)-β-D-葡萄糖基)柚皮素(Melitidin)
檢測到[M+H]+準分子離子峰為m/z 581.3。[M-H]-準分子離子峰為m/z579.0,對其進行子離子掃描(PI),得到m/z459.0為C環(huán)進行RDA裂解丟失苯酚基和一個羰基產(chǎn)生;m/z271.1為柚皮苷配基-7-O-葡糖苷的糖苷鍵斷裂產(chǎn)生。在液質(zhì)聯(lián)用中,與對照品的保留時間、分子離子峰和碎片離子峰的精確相對分子質(zhì)量、質(zhì)譜斷裂行為一致,經(jīng)文獻[1-3]比對,確證該化合物為柚皮苷,分子式為C27H32O14。
檢測到[M+H]+準分子離子峰為m/z595.0。[M-H]-準分子離子峰為m/z593.0,對其進行子離子掃描(PI),得到m/z284.8為忍冬苷的糖苷鍵斷裂產(chǎn)生的;m/z151.0為糖苷鍵斷裂后C環(huán)進行RDA裂解所產(chǎn)生的。在液質(zhì)聯(lián)用中,根據(jù)分子離子峰和碎片離子峰的精確相對分子質(zhì)量、質(zhì)譜斷裂行為與文獻[4]比對,指認該化合物為忍冬苷,分子式為C27H30O15。
檢測到[M+H]+準分子離子峰為m/z579.0。[M-H]-準分子離子峰為m/z577.1,對其進行子離子掃描(PI),得到m/z269.1為野漆樹苷的糖苷鍵斷裂產(chǎn)生。在液質(zhì)聯(lián)用中,與對照品的保留時間、分子離子峰和碎片離子峰的精確相對分子質(zhì)量、質(zhì)譜斷裂行為一致,經(jīng)文獻[1-3]比對,確證該化合物為野漆樹苷,分子式為C27H30O14。
檢測到[M+H]+準分子離子峰為m/z278.9,對其進行子離子掃描(PI),得到m/z261.0,m/z243.2,m/z189.1及m/z131.0。m/z261.0為橙皮內(nèi)酯,支鏈斷裂形成苯駢呋喃離子m/z189.1,丟失一個甲氧基和一個羰基產(chǎn)生m/z131.0。在液質(zhì)聯(lián)用中,與對照品的保留時間、分子離子峰和碎片離子峰的精確相對分子質(zhì)量、質(zhì)譜斷裂行為一致,經(jīng)文獻[3,5-6]比對,確證該化合物為橙皮內(nèi)酯水合物,分子式為C15H18O5。
檢測到[M+H]+準分子離子峰為m/z724.2。[M-H]-準分子離子峰為m/z722.7,對其進行子離子掃描(PI),得到m/z620.8、m/z578.9及m/z270.9,其中m/z620.8為酯鍵斷裂產(chǎn)生,再丟失一個乙?;a(chǎn)生m/z578.9, Melitidin的酯鍵、糖苷鍵斷裂形成柚皮素m/z270.9。在液質(zhì)聯(lián)用中,與Melitidin的保留時間、分子離子峰和碎片離子峰的精確相對分子質(zhì)量、質(zhì)譜斷裂行為一致,經(jīng)文獻[1]比對,確證該化合物為Melitidin,分子式為C33H40O18。
檢測到[M+H]+準分子離子峰為m/z273.2。[M-H]-準分子離子峰為m/z271.0,對其進行子離子掃描(PI),得m/z150.9及m/z106.9。其中m/z150.9為C環(huán)進行RDA裂解丟失苯酚基和一個羰基產(chǎn)生,m/z106.9為A環(huán)斷裂、C環(huán)RDA裂解產(chǎn)生。在液質(zhì)聯(lián)用中,與對照品的保留時間、分子離子峰和碎片離子峰的精確相對分子質(zhì)量、質(zhì)譜斷裂行為一致,經(jīng)文獻[1,3]比對,確證該化合物為柚皮素,分子式為C15H12O5。
檢測到[M+H]+準分子離子峰為m/z261.0,對其進行子離子掃描(PI),得到m/z243.1,m/z189.0及m/z131.2。支鏈斷裂形成苯駢呋喃離子m/z189.0,丟失一個甲氧基和一個羰基產(chǎn)生香豆素類化合物的特征離子m/z 131.2。在液質(zhì)聯(lián)用中,根據(jù)保留時間、分子離子峰和碎片離子峰的精確相對分子質(zhì)量、質(zhì)譜斷裂行為,經(jīng)文獻[3,5-6]比對,指認該化合物為異橙皮內(nèi)酯,分子式為C15H16O4。
經(jīng)過RRLC-MS/MS分析,確證和指認了紅珠膠囊中7個黃酮類成分(新北美圣草苷、櫻桃苷、柚皮苷、忍冬苷、野漆樹苷、Melitidin、柚皮素)和2個香豆素類成分(橙皮內(nèi)酯水合物、異橙皮內(nèi)酯)。本研究揭示了紅珠膠囊的化學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ),有利于監(jiān)控該藥的質(zhì)量[7]。
[1] ZHANG M X,DUAN C Q, ZANG Y Y,et al. Theavonoid composition ofavedo and juice from the pummelo cultivar (Citrusgrandis(L.) Osbeck) and the grapefruit cultivar (Citrusparadisi) from China[J]. Food Chemistry,2011,129:1530-1536.
[2] GALL L G, DUPONT S M, MELLON A, et al. Characterization and content of flavonoid glycosides in genetically modified tomato (Lycopersiconesculentum) fruits [J].Journal of Agriculture and Food Chemistry, 2003, 51:2438-2446.
[3] 劉群娣,謝春燕,閆李麗,等.化橘紅化學(xué)成分的HPLC-DAD-MS/MS分析[J].世界科學(xué)技術(shù):中醫(yī)藥現(xiàn)代化,2011,13(5):864-867.
[4] 劉芳,舒積成,潘景行,等.忍冬苷的合成及其對雷公藤甲素誘導(dǎo)肝損傷的保護作用[J].中國實驗方劑學(xué)雜志,2012,18(5):72-75.
[5] 牛艷,王磊,黃曉君,等.化橘紅香豆素類的化學(xué)成分[J].暨南大學(xué)學(xué)報:自然科學(xué)與醫(yī)學(xué)版,2012,18(5):501-505.
[6] 古淑儀,宋曉虹,蘇薇薇.化州柚中香豆素成分的研究[J].中草藥,2005,36(3):341-343.
[7] 彭維,蘇薇薇,古淑儀,等.原創(chuàng)中藥紅珠膠囊的質(zhì)量標準研究[J].中山大學(xué)學(xué)報:自然科學(xué)版,2013,52(6):110-113.