韓小花，杜永成，張新日，李 毅

(1.山西省人民醫(yī)院呼吸科，太原 030001;2.山西醫(yī)科大學第一醫(yī)院呼吸科，太原 030001)

支氣管哮喘(bronchial asthma)是一種常見的慢性呼吸系統(tǒng)疾病。吸煙與哮喘關(guān)系密切，長期吸煙可增加哮喘發(fā)作的嚴重度和病死率。吸煙可改變哮喘患者氣道炎癥的特點，導致哮喘患者激素治療效果更差，肺功能下降更快。免疫-炎癥機制是近幾年支氣管哮喘研究的熱點，趨化因子的作用亦受到了廣泛關(guān)注。CCR6是趨化因子CCL20唯一的受體，Lukacs NW［1］和 Bracke KR［2］等人的研究表明CCR6不僅在哮喘氣道粘膜免疫中的作用非常重要，而且對于煙草煙霧暴露導致的肺部炎癥具有重要作用。本文通過觀察煙草煙霧暴露對哮喘大鼠氣道CCR6 mRNA及蛋白表達的影響，進一步探究吸煙哮喘氣道炎癥發(fā)生的免疫學機制，以期為臨床治療哮喘尋找新的靶點。

1 材料和方法

1.1 實驗材料和設(shè)備

6～8周齡清潔級健康雄性Wistar大鼠〔山西醫(yī)科大學實驗動物中心提供，合格證號 SXCK(晉)2009-0001〕40只，平均體重(200±20)g。卵白蛋白(OVA)購自美國 Sigma公司，實驗用香煙為湖南中煙工業(yè)公司生產(chǎn)的芙蓉牌過濾嘴香煙 (煙堿1.0 mg/支，焦油12.0 mg/支)。兔抗大鼠 CCR6多克隆抗體試劑盒及SABC(兔IgG)試劑盒均購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司;DAB顯色劑購自武漢博士德生物工程有限公司;MIAS-2000醫(yī)學圖像分析系統(tǒng)為四川川大智勝軟件股份有限公司產(chǎn)品。第一鏈cDNA合成試劑盒(RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit K1622)為加拿大Permentas公司產(chǎn)品;實時熒光定量 PCR儀(Roche LightCycler1.0)為瑞士Roche公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 動物分組與模型制備:40只大鼠按照隨機數(shù)字表法分為4組:對照組、煙霧暴露組、哮喘組和哮喘+煙霧暴露組，每組10只。參照文獻制備哮喘模型［3］:于第 1天和第8天以 10%OVA 1 mL、氫氧化鋁100 mg腹腔注射致敏，第14天后置于透明密閉容器中給予1%OVA溶液60 mL霧化吸入激發(fā)，中等霧量，1次/d，每次30 min，每周5次，以大鼠出現(xiàn)呼吸加快、口唇發(fā)紺、站立不穩(wěn)等表現(xiàn)為激發(fā)成功，連續(xù)激發(fā)8周。對照組:以生理鹽水代替 OVA腹腔注射，第14天后給予生理鹽水霧化(60 mL)8周。參照許三林等［4］自制實驗性大鼠被動吸煙裝置，吸煙室大小(100×80×60)cm。煙霧暴露組:前期制備同對照組，生理鹽水霧化30 min后給予大鼠被動吸煙1次，每次吸煙10支，大約1 h，每周吸煙5 d，共吸煙8周。哮喘 +煙霧暴露組:前期制備同哮喘組，從吸入1%OVA開始，每日于霧化激發(fā)30 min后，給予被動吸煙，共8周，吸煙方法和時間同煙霧暴露組。

1.2.2 標本采集:末次霧化激發(fā)24 h內(nèi)，25%烏拉坦4 mL/kg腹腔注射麻醉動物，行支氣管肺泡灌洗，暴露氣管進行插管，3 mL PBS液反復沖洗3遍，回收的灌洗液離心(1 500 r/min)留取重懸細胞沉淀，行白細胞計數(shù)，同時涂片用于HE染色進行細胞分類計數(shù)。留取右肺組織，放入DEPC處理過的凍存管中－80℃冰箱中凍存，用于 RT-PCR法檢測。左肺以中性甲醛固定24 h，常規(guī)石蠟包埋、切片，用于免疫組織化學染色、蘇木精-伊紅(HE)染色。

1.2.3 BALF細胞計數(shù)及分類:大鼠支氣管肺泡灌洗液行白細胞計數(shù)、HE染色及細胞分類計數(shù)。

1.2.4 Rear-time PCR檢測大鼠肺組織CCR6 mRNA的表達水平:引物由上海生工生物科技有限公司合成。CCR6引物序列:(上游引物)5'-AACATGGTCCTCCTCGTGAC-3'，(下 游 引 物)5'-TACAACACGGGGTTGAGACA-3'，擴增片段大小:137 bp;設(shè)β-actin做內(nèi)參照物。?。?0℃保存的肺組織，提取總 RNA，再合成第一鏈 cDNA，置 －20℃冰箱備用。采用SYBR green熒光染料法反應45個循環(huán)，整個過程收集熒光，使各組內(nèi)每樣本與內(nèi)參擴增效率相同，采用 2－ΔΔCt法［5］計算樣本的原始拷貝數(shù)，分別擴增 CCR6 mRNA和 β-actin。利用相應軟件獲得各組樣本與內(nèi)參β-actin相對應的擴增曲線，讀取樣本 Ct(cycle threshold)值(即在 PCR擴增過程中，擴增產(chǎn)物的熒光信號達到設(shè)定的閾值時所經(jīng)過的擴增循環(huán)次數(shù))，計算ΔCt值(各樣本測定基因與內(nèi)參基因 Ct值的差值)和 ΔΔCt值(其余樣品的ΔCt值和對照樣本相應基因的 ΔCt值之差)，最終得出2－ΔΔCt值(相對于參考因子基因表達的倍數(shù))以獲得四組間CCR6mRNA的相對定量比較，即以正常對照組為參照，其余各組CCR6mRNA相對表達量用參照組的 2－ΔΔCt倍表示。

1.2.5 免疫組織化學染色檢測大鼠氣道CCR6蛋白的表達:石蠟切片厚4 μm，采用過氧化物酶標記的鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連結(jié)法(SABC)測定。按照 SABC試劑盒說明書進行操作，CCR6一抗稀釋濃度為1:100，陽性表達為支氣管上皮細胞胞膜和胞漿內(nèi)有棕黃色顆粒。切片結(jié)果均采用MIAS-2000醫(yī)學圖像分析系統(tǒng)檢測，檢測每支細支氣管上皮細胞的平均光密度(A值)，取5支完整細支氣管的平均值代表該切片CCR6蛋白表達的相對含量。

1.3 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

2.1 大鼠肺組織病理學改變

肺組織HE染色:對照組肺泡及細支氣管形態(tài)、結(jié)構(gòu)正常，支氣管纖毛排列整齊，管腔規(guī)則，僅見少量炎性細胞浸潤，基底膜較薄;煙霧暴露組支氣管纖毛柱狀上皮細胞脫落或變性，氣道壁增厚，氣道壁和肺組織可見巨噬細胞、淋巴細胞和中性粒細胞等炎性細胞浸潤;哮喘組氣道壁和肺組織可見淋巴細胞、嗜酸粒細胞等炎性細胞浸潤，黏膜皺褶增多，部分支氣管上皮壞死、脫落，氣道壁增厚，管腔狹窄;哮喘+煙霧暴露組肺泡腔不規(guī)則擴大，肺泡間隔變薄或斷裂，氣道壁明顯增厚，大量淋巴細胞、嗜酸粒細胞及中性粒細胞浸潤(圖1～4見彩插3)。

2.2 BALF細胞計數(shù)及分類

哮喘組、哮喘 +煙霧暴露組 BALF中白細胞總數(shù)、嗜酸粒細胞、中性粒細胞、淋巴細胞較對照組、煙霧暴露組增加，差異有統(tǒng)計學意義(均 P ＜0.05);哮喘+煙霧暴露組BALF中白細胞總數(shù)和中性粒細胞較哮喘組增加，嗜酸粒細胞較哮喘組減少，差異有統(tǒng)計學意義(均P ＜0.05)，見表1。

2.3 各組大鼠肺組織CCR6基因表達的檢測結(jié)果

利用相應軟件分別獲得各組樣本與內(nèi)參 βactin相對應的擴增曲線(圖5～6見彩插3)以對照組為定標，分別計算得對照組、煙霧暴露組、哮喘組和哮喘+煙霧暴露組的Ct值、△Ct值和△△Ct值，最后算出 2－ΔΔCt值(表 1)。統(tǒng)計學分析哮喘組、哮喘+煙霧暴露組的CCR6mRNA水平均高于對照組、煙霧暴露組，差異有統(tǒng)計學意義(P均 ＜0.01);哮喘+煙霧暴露組的轉(zhuǎn)錄水平高于哮喘組，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。

表1各組大鼠BALF中白細胞總數(shù)及分類計數(shù)(ˉ±s，n=10)Tab．1 Count and classification of white blood cells in the rat BALF

表1各組大鼠BALF中白細胞總數(shù)及分類計數(shù)(ˉ±s，n=10)Tab．1 Count and classification of white blood cells in the rat BALF

注:與對照組比較，aP ＜0.01，bP ＜0.01;與哮喘組比較，cP ＜0.01．Note:aP ＜0.01，bP ＜0.01，compared with the control group;cP ＜0.01，compared with the OVA exposure group．

組別Groups 白細胞總數(shù)WBC(×107/L)嗜酸粒細胞EOS(%)中性粒細胞NEU(%)淋巴細胞LYM(%)巨噬細胞AM(%)對照組Control group 10.1±3.8 1.3±0.7 2.2±1.1 6.3±1 value ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01.8 89.6±2.7煙霧暴露組 Smoke exposure group 47.7±6.8a 0.5±0.3 2.7±1.4 6.6±2.0 90.5±5.4哮喘組OVA exposure group 69.0±3.5b 4.1±1.0a 8.9±2.0a 21.4±3.7a 65.6±3.8a哮喘+暴露組OVA combined smoke 86.7±5.2bc 2.2±1.0ac 19.0±2.8ac 23.8±3.8a 55.2±2.9ac F value 349.1 29.7 129.1 78.4 166.8 P

2.4 各組大鼠氣道CCR6蛋白的表達結(jié)果

CCR6主要表達于支氣管上皮細胞的胞膜和胞漿中，陽性反應產(chǎn)物呈棕黃色。正常對照組，CCR6不表達或僅有弱陽性表達;哮喘組和哮喘+煙霧暴露組的CCR6蛋白表達均明顯高于對照組、煙霧暴露組，差異有統(tǒng)計學意義(P均 ＜0.01);哮喘 +煙霧暴露組高于哮喘組，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)(圖7～10見彩插4)。各組大鼠氣道 CCR6蛋白表達結(jié)果的比較見表2。

表2 各組大鼠氣道CCR6 mRNA及蛋白(A值)水平的比較(±s，n=10)Tab．2 Comparison of CCR6 mRNA and protein levels in the rat airways

表2 各組大鼠氣道CCR6 mRNA及蛋白(A值)水平的比較(±s，n=10)Tab．2 Comparison of CCR6 mRNA and protein levels in the rat airways

注:與對照組比較，aP ＜0.01，bP ＜0.001;與哮喘組比較，cP ＜0.01．Note:aP ＜0.01，bP ＜0.001，compared with the control group;cP ＜0.01，compared with the OVA exposure group．

CCR6 A value對照組組別Groups CCR6 mRNA(2 －ΔΔCtvalue)value ＜0.01 ＜0.01 Control group 1.01±0.52 0.299±0.027煙霧暴露組Smoke exposure group 5.55±0.54a 0.442±0.018a哮喘組 OVA exposure group 8.15±0.88b 0.452±0.013b哮喘+暴露組OVA+smoke 15.16±0.87bc 0.531±0.024bc F value 538.15 163.63 P

3 討論

研究表明煙草煙霧能增加OVA致敏豚鼠氣道急性變應性炎癥反應［6］，吸煙哮喘氣道炎癥的特點是Th2細胞反應加強［7］、氣道壁以中性粒細胞浸潤為主［8］，腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)а等炎性細胞因子水平增加［9］，但其機制尚不完全清楚。本實驗，煙霧暴露組采用小量吸煙，BALF中性粒細胞數(shù)較對照組明顯增加，但所占細胞比例無明顯變化，表明小量吸煙對BALF細胞分類影響不大。但哮喘大鼠煙霧暴露后BALF白細胞總數(shù)及中性粒細胞比例明顯增加，嗜酸粒細胞減少，氣道周圍炎性細胞浸潤更加明顯，進一步證實煙霧暴露可以加重和改變哮喘氣道原有的炎癥反應。

趨化因子(chemokine)是一類結(jié)構(gòu)相似、分子量8～10 kD、具有趨化功能的細胞因子的總稱。趨化因子通過趨化多種炎癥細胞如淋巴細胞、單核細胞、中性粒細胞、樹突狀細胞等，在多種疾病的免疫反應及炎癥損傷中發(fā)揮著重要作用。近年來，趨化因子在哮喘氣道炎癥中的作用受到了廣泛關(guān)注。

趨化因子CCL20是β趨化因子家族的新成員，又稱巨噬細胞炎性蛋白-3α(MIP-3α)，CCR6是CCL20唯一的受體。Lukacs NW 等［1］用 CCR6基因敲除哮喘模型小鼠(CCR6－/－)與野生型小鼠對比研究發(fā)現(xiàn)，CCR6－/－小鼠支氣管嗜酸粒細胞聚集數(shù)量較野生型小鼠降低了10倍，IL-5水平降低了5～8倍，氣道阻力降低了2～3倍，同時血漿中IgE水平亦顯著降低。同樣，由 Leborgne等［10］作者也發(fā)現(xiàn):由CD8+T淋巴細胞啟動招募樹突狀細胞到上皮組織依賴于CCR6/MIP-3α途徑。以上研究表明，氣道上皮CCR6表達水平在哮喘的氣道慢性炎癥中起著非常重要的作用。而Bracke KR等［2］研究中發(fā)現(xiàn)，煙霧暴露的CCR6－/－小鼠肺組織MIP-3α mRNA及其蛋白表達水平較對照組顯著降低;肺泡灌洗液中樹突狀細胞、T淋巴細胞、中性粒細胞數(shù)量較對照組顯著減少;TNF-a基因表達水平較對照組也顯著降低。該研究表明，CCR6表達水平對于煙草煙霧暴露導致的肺部炎癥也具有重要作用。

研究發(fā)現(xiàn)過敏性炎癥時氣道上皮細胞可分泌大量 CCL20［11］，而 CCR6是 CCL20 唯一的受體，本實驗研究了煙霧暴露對哮喘大鼠氣道上皮CCR6表達的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，哮喘+煙霧暴露組大鼠氣道上皮CCR6 mRNA及其蛋白表達水平較對照組、煙霧暴露組和哮喘組均顯著增高，BALF及氣道周圍炎癥細胞明顯增加，表明煙草煙霧暴露可通過增加哮喘大鼠氣道粘膜CCR6表達水平，促進氣道慢性炎癥反應。研究表明CCL20表達水平能夠被TNF-a等許多前炎性細胞因子和空氣微粒上調(diào)［12］，吸煙能夠使 TNF-a 等炎性細胞因子水平增加［2，9］，結(jié)合本實驗結(jié)果，我們推測煙草煙霧暴露可直接或通過TNF-a等炎癥因子的釋放間接作用于氣道上皮細胞，使其產(chǎn)生大量CCL20，后者與其受體CCR6相互作用，選擇性地招募樹突狀細胞、T淋巴細胞及中性粒細胞并使其活化，從而產(chǎn)生大量炎癥介質(zhì)、細胞因子、氧自由基和蛋白酶等，進一步加重了哮喘大鼠氣道炎癥反應。

總之，哮喘氣道慢性炎癥是多種因素綜合作用的結(jié)果，發(fā)生機理非常復雜，煙草煙霧暴露可以加重和改變哮喘氣道原有的炎癥反應，CCR6在其發(fā)生發(fā)展過程中有一定作用，但其具體機制尚未完全明了，有待進一步研究。

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