張榮建，賀爭(zhēng)鳴

(中國(guó)食品藥品檢定研究院，衛(wèi)生部生物技術(shù)產(chǎn)品檢定方法及其標(biāo)準(zhǔn)化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100050)

猴腺病毒(simian adenovirus，SAdV)，是靈長(zhǎng)類動(dòng)物呼吸道和消化道的常見(jiàn)病毒之一，可引起肺炎、咽炎、腸胃炎、結(jié)膜炎等，以糞口途徑傳播為主，主要感染獼猴、非洲綠猴、黑猩猩和狒狒等［1］。SAdV為線性雙鏈DNA病毒，屬腺病毒科，哺乳動(dòng)物腺病毒屬。Esona等人發(fā)現(xiàn)SAdV在外觀無(wú)異常的實(shí)驗(yàn)猴群中高度流行且感染株系呈廣泛的基因多樣性［2］，并存在變種傳染給人的風(fēng)險(xiǎn)［3，4］，也有報(bào)道稱在生產(chǎn)用猴腎細(xì)胞和脊灰減毒疫苗檢定中分離出一些 SAdV 毒株［5］。

目前國(guó)內(nèi)關(guān)于SAdV感染流行情況的研究很少，現(xiàn)有檢測(cè)方法如病毒分離培養(yǎng)等周期長(zhǎng)、特異性較差。我們建立的PCR方法能夠?qū)崿F(xiàn)快速批量檢測(cè)猴群中 SAdV的感染情況，并且靈敏度較高。本方法只需一步PCR就可以將SAdV與鼠腺病毒(MAD)、犬腺病毒(ICH)、禽腺病毒(CELO)區(qū)分開(kāi)來(lái)，并且能檢出不同亞屬的猴腺病毒(SAdV-1、SAdV-3、SAdV-20)。

1 材料和方法

1.1 樣品與毒株來(lái)源

65份食蟹猴和恒河猴糞便樣本采集自國(guó)家藥物安全評(píng)價(jià)中心和協(xié)爾鑫生物資源研究所。中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所生產(chǎn)的五批口服脊髓灰質(zhì)炎減毒活疫(批號(hào)分別為:990420A，990422A，990423A，990428A，990505A)和北京天壇生物生產(chǎn)的一批脊髓灰質(zhì)炎減毒活疫苗(批號(hào):20091106)。BSC-1細(xì)胞，本實(shí)驗(yàn)室保存;陽(yáng)性對(duì)照SAdV-1(VR-195TM)、SAdV-3(VR-1449TM)、SAdV-20(VR-541TM)購(gòu)自美國(guó) ATCC;鼠腺病毒(MAD)、禽腺病毒(CELO)、犬腺病毒(ICH)均本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 試劑及儀器

胎牛血清購(gòu)自杭州四季青公司;PCR熱啟動(dòng)反應(yīng)體系、DL1500 DNA marker、基因組DNA提取試劑盒購(gòu)自大連寶生物工程有限公司;PCR反應(yīng)用引物均由上海生工合成;DNA膠回收試劑盒購(gòu)自杭州Axygen公司。糞便基因組DNA快速提取試劑盒購(gòu)自北京Abigen公司;日立 CP70ME低溫超速離心機(jī)。質(zhì)粒小量快速提取試劑盒(Axygen)購(gòu)自經(jīng)科宏達(dá)公司。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 靶基因的選擇及引物設(shè)計(jì)

用Vector NTI多序列比對(duì)分析已報(bào)道的不同亞屬 SAdV和 MAD、ICH、CELO基因組序列，選擇SAdV保守性高且與 MAD、ICH、CELO序列有差異區(qū)域hexon基因和 pol基因部分序列作為靶序列。針對(duì)該區(qū)域用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)五組引物并合成。同時(shí)，與文獻(xiàn)報(bào)道的引物進(jìn)行比較。

五組引物(1，2，4，5，6)及文獻(xiàn)引物(3)的序列見(jiàn)表1:

2.2 SAdV病毒基因組DNA提取

SAdV病毒的細(xì)胞培養(yǎng)液經(jīng)反復(fù)凍融3次后10 000 r/min離心5 min，收集上清液。

口服糖丸疫苗先用1 mL PBS溶解。培養(yǎng)液上清、疫苗溶劑和液態(tài)疫苗按照基因組DNA提取試劑盒的說(shuō)明書(shū)提取 DNA，400 μL樣品提取 20 μL DNA，－20℃保存。

2.3 PCR反應(yīng)

2.3.1 PCR反應(yīng)體系:反應(yīng)體系總體積 25 μL，其中引物體積 0.5 μL(1 μM)，Taq DNA 聚合酶 0.2 μL(1 U)，10× PCR uffer 2.5 不 μL，dNTP mixture(2.5 mM each)2 μL，dd H2O 17.3 μL，待檢樣品DNA模板2 μL。反應(yīng)條件，95℃預(yù)變性5 min;95℃1 min，55℃ 1 min，72℃ 1 min，共 35 個(gè)循環(huán);72℃再延伸7 min。

2.3.2 PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化:引物濃度選取0.05、0.1、0.2、0.4、0.8 μmol/L 等 5 個(gè)梯度，退火溫度選取 60℃、59.5℃、58.6℃、57.2℃、55.5℃、54.3℃、53.5℃、53.0℃等8個(gè)梯度，Taq酶的量選取0.5 U、1 U、1.5 U、2 U 等 4 個(gè)梯度，循環(huán)數(shù)選擇 20、25、30、40等4個(gè)梯度。

擴(kuò)增產(chǎn)物于1.5%瓊脂糖凝膠(含0.5 μg/mL EB)進(jìn)行電泳鑒定。

表1 SAdV PCR引物序列Tab．1 Sequences of the SAdV primers

表2 PCR條件優(yōu)化結(jié)果Tab．2 Optimization results of the PCR assay

2.4 特異性鑒定

2.4.1 瓊脂糖凝膠電泳鑒定:取禽腺病毒(CELO)、鼠腺病毒(MAD)、犬腺病毒(ICH)及正常BSC-1細(xì)胞培養(yǎng)液。用前述SAdV病毒基因組提取方法提取DNA，分別以這四種DNA為模板，以設(shè)計(jì)的五組引物及文獻(xiàn)報(bào)道的引物在優(yōu)化后的條件下分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

2.4.2 測(cè)序鑒定:利用 DNA膠回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物與pGEM-T克隆載體連接，轉(zhuǎn)化DH5α大腸桿菌，通過(guò)初步酶切鑒定，選擇陽(yáng)性克隆送上海生工公司測(cè)序。

2.4.3 敏感性的測(cè)定:將起始濃度為 47.90 μg/mL的 SAdV DNA樣本做倍比稀釋，分設(shè) 10－1～10－9九個(gè)濃度梯度，使用上述6對(duì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

2.5 PCR檢測(cè)方法的初步應(yīng)用

2.5.1 實(shí)驗(yàn)猴群糞便樣本的檢測(cè):采集單籠飼養(yǎng)的食蟹猴和恒河猴糞便樣本65份，糞便樣本核酸的提取按照糞便基因組DNA快速提取試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。用特異性與敏感性最佳的PCR方法對(duì)糞便樣本核酸進(jìn)行檢測(cè)，擴(kuò)增產(chǎn)物按上述方法進(jìn)行瓊脂糖凝膠鑒定和測(cè)序鑒定。

序列用Bioedit軟件編輯，不同株系的HAdV和SAdV hexon基因序列引自 Genbank。利用 MEGA4軟件進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)生進(jìn)化分析，基于引物之間的序列用Neighbor-joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生進(jìn)化樹(shù)。

2.5.2 動(dòng)物源性生物制品的檢測(cè):取六批口服脊髓灰質(zhì)炎減毒活疫，分別按前述SAdV病毒基因組提取方法提取DNA。選擇特異性與敏感性最佳的PCR方法進(jìn)行檢測(cè)，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)電泳鑒定。

3 結(jié)果

3.1 PCR反應(yīng)及條件優(yōu)化結(jié)果

選取SAdV-1的陽(yáng)性對(duì)照按將各個(gè)因素分別進(jìn)行PCR，PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，按電泳條帶選取最佳反應(yīng)條件。各個(gè)引物PCR反應(yīng)優(yōu)化結(jié)果如表2所示。優(yōu)化條件后各個(gè)引物PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果如圖1，圖2所示。

圖1 引物1、2 PCR反應(yīng)優(yōu)化后結(jié)果Fig．1 Optimization results of PCR with the primer 1，2．

3.2 PCR方法特異性驗(yàn)證

3.2.1 瓊脂糖凝膠電泳初步鑒定:五組引物在以SAdV為模板時(shí)均有明顯目的條帶出現(xiàn)，陰性對(duì)照BSC-1細(xì)胞均無(wú)目的條帶。引物1中ICH有微弱擴(kuò)增，引物 2中 CELO、ICH、MAD均有擴(kuò)增，見(jiàn)圖 3。引物3(文獻(xiàn)引物)PCR特異性檢驗(yàn)結(jié)果顯示G亞屬、A亞屬和 F亞屬的 SAdV-1、SAdV-3和 SAdV-20均有明顯的目的條帶出現(xiàn)，說(shuō)明此PCR方法檢測(cè)譜系廣，不同亞屬的猴腺病毒均能檢出，但 ICH和MAD也有微弱條帶出現(xiàn)表明此方法特異性不是很好，見(jiàn)圖 4。引物 4中只有 SAdV-1、SAdV-3和SAdV-20有明顯的目的條帶出現(xiàn)，ICH、MAD、CELO均無(wú)目的條帶，見(jiàn)圖5，說(shuō)明檢測(cè)譜系廣且特異性好。引物5中只有SAdV-1有明顯目的條帶出現(xiàn)，ICH、MAD、CELO均無(wú)目的條帶，說(shuō)明第五組引物有較好的特異性，見(jiàn)圖6。

圖2 引物3、4、5、6 PCR反應(yīng)優(yōu)化后結(jié)果Fig．2 Optimization results of PCR with the primer 3，4，5，6．

圖3 引物1、2特異性檢測(cè)Fig．3 Specificity test for the primer 1，2．

與文獻(xiàn)引物相比，引物1、4、5均有較好的特異性，結(jié)果見(jiàn)圖 3，4，6，8。

3.2.2 測(cè)序鑒定:將陽(yáng)性擴(kuò)增片斷進(jìn)行克隆測(cè)序，測(cè)序結(jié)果用 BLAST與 NCBI中 SAdV-1序列比對(duì)，核苷酸符合率達(dá)99%(325/328)，證明是要擴(kuò)增的SAdV-1目的片段，說(shuō)明該法特異性好。

3.2.3 敏感性鑒定:PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳顯示引物3(文獻(xiàn)引物)能檢測(cè)到的SAdV模板最高稀釋度為10－4，所能檢測(cè)到的最小基因組濃度是4.79 ng/mL。而設(shè)計(jì)的1、2、4、5組引物能檢測(cè)到的最高稀釋度分別為:10－4、10－5、10－6、10－3。引物 4的靈敏性為文獻(xiàn)引物的100倍。

圖5 引物4特異性驗(yàn)證Fig．5 Specificity test for the primer 4．

六組引物不同的PCR檢測(cè)方法經(jīng)特異性和敏感性鑒定可看出，引物4進(jìn)行的PCR檢測(cè)方法的特異性、靈敏度最佳，檢測(cè)譜系廣，不同亞屬的猴腺病毒均能檢出，適合作為檢測(cè)猴腺病毒的分子生物學(xué)方法。

3.2.4 檢測(cè)方法的初步應(yīng)用:

3.2.4.1猴糞便樣本的 PCR檢測(cè):經(jīng) PCR檢測(cè)，其中有15份食蟹猴樣本和17份恒河猴樣本出現(xiàn)328 bp的目的條帶，呈 SAdV陽(yáng)性。我國(guó)實(shí)驗(yàn)猴群中SAdV感染流行情況見(jiàn)表3，食蟹猴感染率高于恒河猴為57.7%，廣東地區(qū)感染率為60%，高于其它三個(gè)地區(qū)。

圖6 引物5特異性驗(yàn)證Fig．6 Specificity test for the primer 5．

3.2.4.2 SAdV陽(yáng)性樣本的測(cè)序鑒定:選取23份SAdV陽(yáng)性樣本測(cè)序，并將序列與 NCBI收錄的SAdV序列進(jìn)行比對(duì)，同源性為91% ～100%。證明了檢測(cè)方法的準(zhǔn)確性，同時(shí)也說(shuō)明建立的PCR方法能夠同時(shí)檢測(cè)出不同型別的SAdV。

3.2.4.3 SAdV系統(tǒng)發(fā)生進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建:如圖7所示，系統(tǒng)進(jìn)化發(fā)生分析表明實(shí)驗(yàn)猴群中感染的SAdV型別呈廣泛的基因多樣性，主要分為3個(gè)大基因簇，其中最大一簇與HAdV-G亞屬腺病毒進(jìn)化距離很近，屬于 HAdV-G亞屬如17M．f等;另一簇與其它亞屬相比，與HAdV-G亞屬進(jìn)化距離較近，但與上一簇是明顯兩個(gè)分支如11M．f，與 G亞屬的SAdV-7序列同源性為91%。最后一簇與新發(fā)現(xiàn)的SAdV-49和SAdV-50株系接近如 xie32M．m，這一基因簇還沒(méi)有命名且與其它亞屬進(jìn)化距離較遠(yuǎn)，是否代表新的SAdV亞屬還需進(jìn)一步詳細(xì)研究。

3.4.2.4 猴源性生物制品的檢測(cè):

脊髓灰質(zhì)炎減毒活疫苗分別提取DNA，經(jīng)PCR檢測(cè)，均未檢出SAdV核酸序列，見(jiàn)圖8。

4 分析與討論

PCR方法由于其安全、簡(jiǎn)便快速的特點(diǎn)被廣泛應(yīng)用。SAdV基因組全長(zhǎng)約34 000 bp，G+C含量為55.2%［5］，hexon基因和 pol基因部分序列進(jìn)化上高度保守是PCR引物設(shè)計(jì)的靶序列，也常用于系統(tǒng)發(fā)生進(jìn)化分析［6］。最近，Esona 等［7］人針對(duì) hexon 基因設(shè)計(jì)了一對(duì)簡(jiǎn)并引物建立了SAdV PCR檢測(cè)方法并對(duì)廣州地區(qū)猴群進(jìn)行了篩查，發(fā)現(xiàn)SAdV高度流行且感染株系呈廣泛的基因多樣性。經(jīng)特異性驗(yàn)證該P(yáng)CR檢測(cè)方法特異性較差，不能將SAdV與犬腺病毒(ICH)和鼠腺病毒(MAD)區(qū)分開(kāi)來(lái)。

本實(shí)驗(yàn)成功篩選出一對(duì)特異性好、靈敏度更高的引物，目的條帶大小為328 bp，測(cè)序結(jié)果與NCBI發(fā)表的SAdV-1序列同源性為99%。對(duì)引物濃度、Taq酶用量、退火溫度、循環(huán)次數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，確定了最佳PCR反應(yīng)條件，建立了 SAdV的 PCR檢測(cè)方法。本方法只需一步PCR就可以將SAdV與MAD、ICH、CELO區(qū)分開(kāi)來(lái)，并且能檢出不同亞屬的猴腺病毒(SAdV-1、SAdV-3、SAdV-20)，所能檢測(cè)到的最小DNA模板濃度為47.9 pg/mL，比文獻(xiàn)引物靈敏度提高100倍。

Roy的研究表明SAdV可能感染猴小腸上皮細(xì)胞，造成SAdV慢性感染并由腸道持續(xù)向外排毒，糞便中檢出率高［8］。用建立的 PCR檢測(cè)方法調(diào)查SAdV的感染流行情況，發(fā)現(xiàn)我國(guó)實(shí)驗(yàn)猴群中SAdV高度流行且呈現(xiàn)出廣泛的基因多樣性，與Esona等人報(bào)道一致。

由于SAdV經(jīng)常呈慢性持續(xù)感染狀態(tài)［9］，且在外觀無(wú)異常的恒河猴和食蟹猴種群中高度流行，最早發(fā)現(xiàn)的幾株猴腺病毒如 SAdV-1、SAdV-3等是從脊灰疫苗生產(chǎn)和檢定過(guò)程中分離，因此，需要加強(qiáng)對(duì)實(shí)驗(yàn)猴群和猴源性生物材料以及相關(guān)生物制品中SAdV的檢測(cè)，避免人類感染SAdV的潛在風(fēng)險(xiǎn)。用建立的PCR法對(duì)猴源性生物制品進(jìn)行檢測(cè)，未檢測(cè)到SAdV核酸序列，初步說(shuō)明目前猴源性生物制品污染SAdV的幾率較小，生產(chǎn)和檢定過(guò)程中質(zhì)量控制很嚴(yán)格。

表3 PCR方法調(diào)查獼猴糞便樣本中SAdV的感染流行情況Tab．3 The epidemiological study of SAdV infection detected in rhesus monkey feces by PCR

圖7 Mega軟件比對(duì)人腺病毒和猴腺病毒六鄰體基因一段序列(286 bp)建立進(jìn)化樹(shù) (HAdV、SAdV序列來(lái)自GenBank中，M．m代表恒河猴，M．f代表食蟹猴)Fig．7 Generation of an evolutionary tree by comparing the sequences(286 bp)of a fragment of hexon gene of human and monkey adenoviruses using Mega software．Root in GenBank;M．m represents rhesus;M．f represents Macaca fascicularis．

圖8 猴源性生物制品的檢測(cè)Fig．8 Detection of SAdV in monkey-origin biological products．

我們所建立的檢測(cè)SAdV核酸的PCR方法具有快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)，可實(shí)際應(yīng)用于監(jiān)測(cè)猴群SAdV感染，通過(guò)隔離持續(xù)向外排毒個(gè)體，切斷糞口途徑，可以有效避免SAdV在猴群中的傳播，也適用于猴源性生物制品SAdV污染的檢測(cè)，對(duì)于建立高質(zhì)量的實(shí)驗(yàn)猴群和保證猴源性生物制品安全意義重大。

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