李瑞嬌，馮 潔，謝建云，胡建華，高 誠

(1．東華大學化學化工與生物工程學院，上海 201620;

2．上海實驗動物研究中心，上海市實驗動物質(zhì)量監(jiān)督檢驗站，上海 201203)

嚙齒動物螺桿菌(rodent Helicobacter)屬革蘭氏 陰性菌，通常寄居于嚙齒動物消化道內(nèi)，包括盲腸、結(jié)腸以及肝膽管系統(tǒng)［1］。自從1992年首次發(fā)現(xiàn)鼠型螺桿菌以來，目前已陸續(xù)分離到包括有肝螺桿菌(Helicobacter hepaticus)、膽汁螺桿菌(Helicobacter bilis)、嚙齒類螺桿菌(Helicobacter rodentium)在內(nèi)的至少十三種嚙齒動物螺桿菌［2］。嚙齒動物螺桿菌的感染會嚴重影響實驗動物的品質(zhì)，其中肝螺桿菌可自然感染多個品系小鼠并直接導致急、慢性肝炎的產(chǎn)生，并對 A/JCr小鼠肝癌發(fā)生有促進作用［3］，膽汁螺桿菌則易引起各種腸炎疾病，并與肝炎發(fā)生相關(guān)，例如多灶慢性肝炎［4］，而感染嚙齒類螺桿菌也會導致小鼠肝炎、盲腸結(jié)腸炎等多種腸肝疾病，另外膽汁螺桿菌與嚙齒類螺桿菌的同時存在，會引起SCID小鼠腹瀉［5］。因此，若誤將感染螺桿菌的動物用于科研或生物安全性評價等試驗中，較易引起實驗數(shù)據(jù)混亂，對結(jié)果產(chǎn)生較為嚴重的干擾，甚至引發(fā)更嚴重的后果［2］。

嚙齒動物螺桿菌的診斷檢測，目前有很多種方法，包括傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)法、ELASA、PCR 等［6，7］。PCR診斷是螺桿菌分子診斷最優(yōu)勢的方法，其因快速、敏感、特異等優(yōu)點而得到廣泛的應用，主要有普通 PCR、巢式 PCR、多重 PCR、熒光核酸酶 PCR等［8］。多重PCR是以普通 PCR反應體系為基礎，但升級為同時加入多對引物，同時擴增出多條目的片段，以達到同時檢測多種病原體，快速、高效的新型方法［9］。本實驗旨在建立一種敏感、特異、高效的多重PCR方法，以達到可同時檢出肝、膽汁、嚙齒類三種螺桿菌的目的，為快速診斷提供良好的基礎。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 質(zhì)粒:分別包含肝、膽汁、嚙齒類三種螺桿菌16S rRNA片段的三種陽性質(zhì)粒模板由上海實驗動物研究中心保存。

1.1.2 試劑:質(zhì)粒抽提試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司，Taq DNA 聚合酶，PCR buffer，Mg2+，dNTP，100 bp DNA ladder marker均購自寶生物工程(大連)有限公司，瓊脂糖購自西班牙Bio West公司，GoldViewTM核酸染料購自上海賽百盛(SBS)基因技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 引物的設計與合成:根據(jù)GenBank中已發(fā)表的肝、膽汁、嚙齒類三種螺桿菌16S rRNA序列，參照文獻分別設計合成三對特異性引物［10，11］。

1.2.2 普通PCR:使用質(zhì)粒抽提試劑盒對本室保存的陽性重組質(zhì)粒進行DNA提取，作為單重PCR的模板進行擴增。反應體系為20 μL，其中包括 PCR buffer、dNTP 200 μmol/L、Taq E 0.15 U、引物各 0.5 μmol/L、模板 3 ng，去離子水補足至 20 μL。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。并將PCR產(chǎn)物回收后純化后測序，與比對。

單重PCR的敏感度測定方法如下:分別測定肝、膽汁、嚙齒類三種質(zhì)粒模板濃度，將濃度調(diào)整至1 ng/μL，再以此為基礎，進行10倍梯度稀釋，終濃度為 1 ng、10－1ng、10－2ng、、10－3ng、10－4ng、10－5ng、10－6ng、10－7ng、10－8ng，各取 1 μL 作為模板，分別進行PCR擴增，從而測定單重PCR的敏感度。

1.2.3 多重PCR條件優(yōu)化:根據(jù)單重PCR的反應體系，將三對引物等比混合加入到同一個反應體系中進行擴增，根據(jù)擴增結(jié)果對反應條件和體系進行優(yōu)化，包括退火溫度，Mg2+濃度，dNTP濃度，引物濃度等。

1.2.4 多重PCR條件電泳檢測:取10 μL PCR產(chǎn)物，在濃度為2%的瓊脂糖凝膠中100 V電壓電泳時間90 min，以確保不同大小的擴增產(chǎn)物可以區(qū)分開。目的條帶在凝膠成像系統(tǒng)中分析。

1.2.5 多重PCR特異性檢測;為檢測引物的特異性，相互之間是否會產(chǎn)生交叉反應，本試驗設計了如下引物和模板組合，對多重PCR的特異性進行檢測，具體組合情況見表2。

表1 螺桿菌屬16SrRNA基因PCR擴增引物Tab．1 The sequences of primers used to amplify 16SrRNA gene of helicobacters

表2 多重PCR特異性檢測方法Tab．2 specific multiplex PCR detection method

1.2.6 多重PCR敏感度測定:取梯度稀釋好的三種質(zhì)粒模板各1 μL加入到已優(yōu)化好的 PCR體系中，進行PCR擴增。根據(jù)電泳結(jié)果對多重 PCR體系進行敏感度的測定。

2 結(jié)果

2.1 普通PCR

2.1.1 測序:將測序結(jié)果與GenBank所發(fā)表的肝、膽汁、嚙齒類三種螺桿菌序列進行對比，同源性達99%以上。

2.1.2 敏感度檢測:電泳結(jié)果展示，在單重PCR中肝螺桿菌的敏感度達到10－6ng，膽汁螺桿菌和嚙齒類螺桿菌的敏感度均達到10－5ng(圖1－3)。

2.2 多重PCR反應體系和條件的優(yōu)化

圖1 普通PCR肝螺桿菌敏感度Fig．1 Sensitivity test of the PCR for detection H．hepaticus．

根據(jù)上述試驗設計，我們主要對退火溫度，Mg2+濃度，dNTP濃度，引物濃度等進行了調(diào)整。通過優(yōu)化以上條件，最終確定最佳退火溫度為52°C(見圖 4)，Mg2+濃度為 2.0 mmol/L(圖 5)，dNTP 濃度為 200 μmol/L(圖 6)，引物濃度為 0.625 μmol/L(圖 7)．

2.3 多重PCR特異性試驗

用優(yōu)化好的多重PCR反應條件，對不同的引物和模板組合進行擴增，每個反應都能擴增出預期的目的條帶。加入單一模板時均只有一個目的條帶，加入雙模板時均為兩個目的條帶，加入三種模板時，所有三個目的條帶均能有效擴增出。表明本文建立的多重PCR方法對三種螺桿菌能進行有效的擴增，具有較好的特異性(圖8)。

2.4 多重PCR敏感性試驗

對優(yōu)化好的多重PCR方法進行敏感性試驗，從圖9可以看出肝、膽汁、嚙齒類三種螺桿菌敏感度均可達到10－5ng，即10 fg。和單重 PCR相比，膽汁螺桿菌和嚙齒類螺桿菌的敏感性相當，而肝螺桿菌的敏感性稍低，大約降低了一個數(shù)量級。(圖9)

圖2 普通PCR膽汁螺桿菌敏感度Fig．2 Sensitivity test of the PCR for detection H．bilis．

圖3 普通PCR嚙齒類螺桿菌敏感度Fig．3 Sensitivity test of the PCR for detection H．rodentium．

圖4 不同退火溫度對多重PCR的影響Fig．4 The influence of different Annealing temperature for the multiplex PCR．

3 討論

圖5 不同Mg2+濃度對多重PCR的影響Fig．5 The influence of different Mg2+concentration for the multiplex PCR．

圖6 不同dNTP濃度對多重PCR的影響Fig．6 The influence of different dNTP concentration for the multiplex PCR．

文獻顯示［1，2，7，16］，目前我國的大小鼠已存在不同程度的螺桿菌感染，尤其是肝螺桿菌和膽汁螺桿菌的感染已廣泛存在于實驗室以及一些大小鼠養(yǎng)殖基地。而且已有報道這類細菌不僅在人或動物的胃炎、消化性潰瘍、胃惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起到致病作用，也可能與腸道、膽道、肝臟的炎癥性疾病和一些腫瘤的發(fā)生相關(guān)［17］。但嚙齒動物螺桿菌感染的動物大多數(shù)以慢性、潛伏性感染為主［7］，無明顯癥狀，故對嚙齒動物是否攜帶菌種的觀察及檢測造成了一定難度。因此，建立一種快速、敏感、特異的診斷方法顯得尤為重要。

圖7 不同引物濃度對多重PCR的影響Fig．7 The influence of different primer concentrations the multiplex PCR．

圖8 多重PCR特異性Fig．8 Specificity test of the multiplex PCR detection．

多重PCR作為一種快速省時，特異性強，靈敏度高而且較為可靠的病原檢測方法，近年來在很多領域都有著較為廣泛的應用，尤其體現(xiàn)在對各種病原微生物的檢測。高正琴、張強［18］等建立的肝螺桿菌多種毒力基因的多重PCR檢測方法，不僅解決了肝螺桿菌體外培養(yǎng)的困難，操作也較傳統(tǒng)的細菌學分離培養(yǎng)法大幅度簡化，為其后續(xù)大規(guī)模檢測應用中節(jié)省了大量時間。李晨等［19］通過對水產(chǎn)病原菌的多重PCR檢測認為，相比一般的生化檢測方法，多重PCR明顯的優(yōu)勢體現(xiàn)為省時、靈敏，但對比特異性和敏感度同樣優(yōu)異的基因芯片技術(shù)，多重PCR的前期材料準備簡單和成本較低在實踐應用中更便于廣泛推廣。另外，細菌學多重PCR檢測普遍顯示［8-11］，針對免疫學交叉反應較為明顯的干擾，多重PCR的單管操作對特異性結(jié)果的顯示更為精準。通過大量與形態(tài)學、生理學、生物化學、免疫學等方法比較的實驗結(jié)果明確展示［16-20］，多重PCR方法是一種值得推廣，具有較好發(fā)展前景的病原檢測方法。

圖9 多重PCR敏感度分析Fig．9 Sensitivity test of the multiplex PCR for detection H．hepaticus，H．bilis，H．rodentium．

本實驗建立的肝、膽汁、嚙齒類三種螺桿菌多重PCR檢測方法，能夠快速而準確地檢測嚙齒動物回盲內(nèi)容物中是否存在上述三種螺桿菌，該方法不僅具備了普通PCR準確、敏感的優(yōu)勢，而且大大提高了檢測效率，節(jié)省了試劑，為大范圍的流行病學調(diào)查提供了技術(shù)支持。

多重PCR方法建立很重要的一步在于PCR反應條件的優(yōu)化，據(jù)文獻查閱以及預實驗，確定對多重PCR影響較大的條件主要包括退火溫度，Mg2+濃度，dNTP濃度，引物濃度，其中退火溫度的優(yōu)化又更為重要，退火溫度的測定，直接決定了PCR反應的結(jié)果［12-15］。退火溫度過高或過低，都會導致后續(xù)條件優(yōu)化的困難以及菌種檢測。本實驗通過對以上幾種條件分別進行單一變量優(yōu)化，最終獲得了最佳擴增效果。

在PCR方法建立過程中，特異性的驗證也是必不可少的一環(huán)，本實驗通過不同的引物和模板組合進行交叉檢驗，結(jié)果證明了本文構(gòu)建的多重PCR方法特異性完全符合要求。

另外，在對多重PCR敏感度的檢測中發(fā)現(xiàn)，建立的該多重PCR體系對肝、膽汁、嚙齒類三種螺桿菌的敏感度分別為10 fg、10 fg、10 fg，而在此前進行的普通PCR中三種螺桿菌的敏感度分別為1fg、10fg、10fg。兩組數(shù)據(jù)對比可發(fā)現(xiàn)，構(gòu)建的多重 PCR中各對引物擴增時的互相競爭并不明顯，故采用多重PCR也可得到較為良好的效果。由此可見，該多重PCR方法具有可行性。

通過多種比較，可表明，本文建立的螺桿菌多重PCR檢測方法具有高效、敏感、特異的優(yōu)點，可以應用在嚙齒動物螺桿菌檢測中。

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