袁海峰，李 璽，權(quán)乾坤，王寧寧，劉 穎，李 明

（西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院，西安710004）

阿爾茨海默?。ˋlzheimer’s disease，AD）的病理改變是腦內(nèi)β淀粉樣肽（β－Amyloid，Aβ）沉積和清除失衡。研究發(fā)現(xiàn)抗腦內(nèi)Aβ聚集和沉積治療不僅可以消除腦內(nèi)Aβ沉積，而且有緩解認(rèn)知障礙的作用，成為當(dāng)前AD治療研究的熱點(diǎn)[1]。最近研究表明[2]，低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白（LDL receptor－related protein LRP）除了可以通過內(nèi)吞作用清除Aβ外，還可以介導(dǎo)腦內(nèi)Aβ經(jīng)血腦屏障的外流轉(zhuǎn)運(yùn)入血從而清除Aβ。復(fù)方中藥腦爾康的前期研究結(jié)果顯示該藥具有抑制AD模型小鼠大腦皮層和海馬膽堿酯酶活性[3]、改善AD模型小鼠學(xué)習(xí)記憶的作用[4]，初步闡明了該方抗癡呆的作用機(jī)理。本實(shí)驗(yàn)擬研究其對(duì)LRP的表達(dá)的影響，旨在探討其干預(yù)Aβ沉淀的作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 7周齡健康雄性SD大鼠48只，由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，體質(zhì)量（220±10）g，合格證號(hào)SCXH（陜）2007－001。將其隨機(jī)分為6組：空白組、模型組、吡拉西坦組及腦爾康大、中、小劑量組，每組8只。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器 轉(zhuǎn)輪式石蠟切片機(jī)（德國(guó)Leica公司，型號(hào)為RM2135）；光學(xué)顯微鏡（日本Olympus公司，型號(hào)為BH22）；圖像信號(hào)采集分析系統(tǒng)（德國(guó)Leica公司，型號(hào)為Qwin550CW）；大鼠腦立體定位儀（日本太陽(yáng)株式會(huì)社，型號(hào)為SN－3）。

1.1.3 藥物與試劑 復(fù)方中藥腦爾康由人參10g，川芎10g，生地15g，益智仁12g，冰片1g等組成，生藥飲片由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院中藥房提供，按傳統(tǒng)方法水煎，水浴濃縮至含生藥10g·mL－1，4℃保存?zhèn)溆?。吡拉西坦，宜昌人福藥業(yè)有限責(zé)任公司生產(chǎn)，批準(zhǔn)文號(hào)為國(guó)藥準(zhǔn)字H42022130，生理鹽水配置成濃度0.25g·mL－1的溶液，4℃保存?zhèn)溆?。Aβ1－42兔抗鼠多克隆抗體、LRP兔抗鼠多克隆抗體、免疫組化試劑盒，購(gòu)于北京博奧森生物技術(shù)有限公司。Aβ1－42溶于無菌生理鹽水（2μg·μL－1），用前37℃孵育7d，使其成為凝聚態(tài)。多聚賴氨酸及DAB顯色劑購(gòu)于武漢博士德生物工程有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動(dòng)物模型的建立 選擇大鼠雙側(cè)海馬CA1區(qū)為注射靶區(qū)（前囟向后3.0mm，中線旁開2.2mm，硬腦膜下2.8mm），一次性注射凝聚態(tài)Aβ1－42制備AD模型[5]。大鼠經(jīng)10%水合氯醛（3.5mL·kg－1）腹腔注射麻醉，固定于大鼠立體定位儀，參照包新民[6]等 《大鼠腦立體定向圖譜》，用牙科鉆鉆開顱骨，微量注射器自硬腦膜垂直進(jìn)針2.8mm，緩慢注射10min，留針5min，每側(cè)注射5μL，模型組、吡拉西坦組及腦爾康大、中、小劑量組大鼠注射Aβ1－42（2μg·μL－1），空白組大鼠注射等體積生理鹽水。術(shù)后局部撒復(fù)方新諾明藥粉防止感染，縫合頭皮，每只大鼠肌肉注射青霉素4萬U，連續(xù)3d。

1.2.2 行為學(xué)測(cè)試 采用Y型電迷宮箱進(jìn)行行為學(xué)測(cè)試[7]。Y型電迷宮為三等分輻射式反射箱，反射箱三個(gè)臂的頂端有信號(hào)燈，信號(hào)燈亮?xí)r此臂安全無電。大鼠學(xué)習(xí)、記憶成績(jī)分別以其連續(xù)10次測(cè)試中有9次（9/10）正確反應(yīng)時(shí)所需的電擊次數(shù)表示。安全區(qū)以無規(guī)則次序變換，以訓(xùn)練大鼠辨別燈光刺激及安全方位的能力。訓(xùn)練時(shí)將大鼠放入起步區(qū)，通過電刺激控制器電擊動(dòng)物足部，電擊電壓為30V。大鼠遭受電擊后，若直接逃至安全區(qū)為正確反應(yīng)，反之為錯(cuò)誤反應(yīng)。記錄大鼠達(dá)到連續(xù)10次電擊中9次（9/10）正確反應(yīng)前所經(jīng)受的電擊次數(shù)作為學(xué)習(xí)成績(jī)。24h后測(cè)試記憶成績(jī)，仍以達(dá)到（9/10）正確反應(yīng)前所經(jīng)受的電擊次數(shù)表示。行為學(xué)測(cè)試在造模3d后及藥物干預(yù)28d后各進(jìn)行一次。

1.2.3 給藥方法 各組給藥按照 “實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與人按體表面積等計(jì)量換算比例”換算[8]，計(jì)算出大鼠腦爾康大、中、小劑量組分別為60、30、15g·kg－1·d－1；吡拉西坦劑量為：0.375g·kg－1·d－1?？瞻捉M、模型組灌等體積生理鹽水，第一次行為學(xué)測(cè)試后開始灌胃，每天灌胃1次，上午10點(diǎn)左右進(jìn)行，連續(xù)28d。

1.2.4 組織標(biāo)本制備 最后一次學(xué)習(xí)記憶成績(jī)測(cè)試30min后，10%水合氯醛（3.5mL·kg－1）腹腔麻醉，開胸暴露心臟，經(jīng)左心室插管至主動(dòng)脈，剪開右心耳，快速灌注生理鹽水，至肝臟變白改灌注液為4%多聚甲醛，灌注時(shí)間約60min，見大鼠尾巴、四肢僵硬視為滿意，然后開顱取腦，標(biāo)記前囟點(diǎn)，在前囟后2.0mm處、前囟后4.0mm處分別用刀片垂直切下，即以海馬注射點(diǎn)（前囟后3.0mm）為界前后1.0mm冠狀垂直切取，將切下的中間腦組織浸入4%多聚甲醛，置于4℃冰箱48h，其余腦組織棄去，后流水沖洗24h，然后脫水、透明、浸蠟、包埋。參照包新民[6]等 《大鼠腦立體定向圖譜》，每個(gè)標(biāo)本作冠狀切片，在前囟后3.0mm位置連續(xù)切片3張，片厚4μm。

1.2.5 海馬Aβ1－42、LRP的檢測(cè) 采用免疫組織化學(xué)法（SP法）分別檢測(cè)各組大鼠海馬CA1、CA3和齒狀回Aβ1－42、LRP的陽(yáng)性表達(dá)情況，Aβ1－42、LRP的一抗?jié)舛确謩e為1∶1000、1∶500，染色步驟按說明書進(jìn)行，PBS代替一抗作陰性對(duì)照。采用圖象處理與分析系統(tǒng)對(duì)陽(yáng)性表達(dá)進(jìn)行灰度分析，每張切片同一區(qū)域中，隨機(jī)選取4個(gè)視野，檢測(cè)面積相同，取其平均值作為該切片目標(biāo)區(qū)域的平均灰度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用SPSS 11.0統(tǒng)計(jì)軟件處理，計(jì)量資料數(shù)據(jù)用（±s）表示，方差齊性檢驗(yàn)采用Levene檢驗(yàn)，正態(tài)性檢驗(yàn)采用Shapiro－wilk檢驗(yàn)。符合方差分析條件的數(shù)據(jù)多組均數(shù)間比較采用單因素方差分析，兩兩均數(shù)間比較采用LSD－t檢驗(yàn)；不符合方差分析條件的數(shù)據(jù)，多組均數(shù)間比較采用Kruskal－Wallis秩和檢驗(yàn)，兩兩均數(shù)間比較采用Wilcoxon秩和檢驗(yàn)。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 Aβ1－42對(duì)大鼠一般狀態(tài)的影響

大鼠術(shù)后24h精神狀態(tài)均呈現(xiàn)萎靡不振，活動(dòng)減少，飲食差，對(duì)刺激的反應(yīng)減弱?？瞻捉M大鼠恢復(fù)迅速，模型組恢復(fù)相對(duì)緩慢。

2.2 腦爾康對(duì)AD模型大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響

各用藥組的學(xué)習(xí)與記憶能力比模型組明顯提高（P＜0.01）；腦爾康大劑量組作用優(yōu)于西藥組（P＜0.05），腦爾康三個(gè)劑量組之間比較，大劑量組學(xué)習(xí)能力優(yōu)于中、小劑量組（P＜0.05或P＜0.01），三個(gè)劑量組之間記憶能力無明顯差別（P＞0.05），見表1。

表1 腦爾康對(duì)AD模型大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響（x±s，灰度值）

2.3 腦爾康A(chǔ)D模型大鼠海馬Aβ1－42表達(dá)的影響

模型組海馬區(qū)Aβ1－42陽(yáng)性反應(yīng)物質(zhì)比空白組明顯增多（P＜0.01）；各用藥組Aβ1－42表達(dá)比模型組明顯減少（P＜0.01）；在海馬DG區(qū)，腦爾康大劑量組作用優(yōu)于吡拉西坦組（P＜0.05），腦爾康三個(gè)劑量組比較差異顯著（P＜0.05或P＜0.01），以大劑量組Aβ1－42的表達(dá)最少，見表2、圖1。

表2 腦爾康對(duì)AD模型大鼠海馬Aβ1－42表達(dá)的影響（±s，灰度值）

表2 腦爾康對(duì)AD模型大鼠海馬Aβ1－42表達(dá)的影響（±s，灰度值）

注：與空白組比較＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；與模型組比較▲▲P＜0.01；與吡拉西坦組比較■P＜0.05，■■P＜0.01；與腦爾康小劑量組比較□P＜0.05，□□P＜0.01；與腦爾康中劑量組比較◇P＜0.05。

組別 n CA1 CA3 DG空白組8 177.43±5.13 167.43±1.65 165.66±3.01模型組 7 158.18±2.98＊＊ 157.70±2.65＊＊ 160.24±2.43＊＊吡拉西坦組 8 167.35±1.52＊＊▲▲ 165.70±1.67＊＊▲▲ 163.63±1.44＊＊▲▲腦爾康小劑量組 8 160.71±2.04＊＊▲▲■■ 159.12±2.12＊＊▲▲■■ 163.47±1.80＊＊▲▲■■腦爾康中劑量組 8 162.32±1.61＊＊▲▲□ 159.12±1.67＊＊▲▲□ 167.16±1.48＊＊▲▲□__腦爾康大劑量組 8 168.34±1.16▲▲□□◇ 167.62±1.71＊▲▲□□◇ 165.23±1.73▲▲■□□◇

圖1 各組大鼠海馬Aβ1－42表達(dá)（普通光學(xué)顯微鏡，×400）

2.4 腦爾康A(chǔ)D模型大鼠海馬LRP表達(dá)的影響

模型組與空白組比較，各海馬區(qū)陽(yáng)性反應(yīng)物質(zhì)表達(dá)無明顯差異（P＞0.05）；各用藥組LRP表達(dá)比模型組增多（P＜0.01或P＜0.05）；中藥三個(gè)劑量組之間比較存在差異（P＜0.05或P＜0.01），以大劑量組LRP的表達(dá)最多，見表3、圖2。

表3 腦爾康對(duì)AD模型大鼠海馬LRP表達(dá)的影響（±s，灰度值）

表3 腦爾康對(duì)AD模型大鼠海馬LRP表達(dá)的影響（±s，灰度值）

注：與空白組比較＊P＜0.05；與模型組比較▲P＜0.05；▲▲P＜0.01；與吡拉西坦組比較■P＜0.05，■■P＜0.01；與腦爾康小劑量組比較□P＜0.05，□□P＜0.01；與腦爾康中組之間比較◇P＜0.05。

CA1 CA3 DG空白組組別 n 8 164.52±2.61 165.72±1.91 167.38±1.23模型組 7 168.71±1.21 168.70±1.31 168.78±1.26吡拉西坦組 8 166.87±1.47＊▲ 163.81±1.56＊▲▲ 162.92±2.18＊▲▲腦爾康小劑量組 8 168.82±1.47■ 167.50±1.73＊■■ 166.33±1.57▲■■腦爾康中劑量組 8 165.16±1.56＊▲▲□ 162.13±1.28＊▲▲ 163.29±1.17＊▲▲■□腦爾康大劑量組 8 162.69±1.22＊▲▲□□◇ 162.12±2.26＊▲▲□□ 161.09±3.15＊▲▲□□◇

圖2 各組大鼠海馬LRP表達(dá)（普通光學(xué)顯微鏡，×400）

3 討 論

阿爾茨海默病的三大特征性病理改變?yōu)椋豪夏臧摺⑸窠?jīng)纖維纏結(jié)和神經(jīng)元大量缺失，細(xì)胞外沉積的老年斑是AD的一個(gè)關(guān)鍵病理特征，主要由大腦皮層及腦區(qū)細(xì)胞間隙的Aβ沉積而成[9]，主要構(gòu)成成分是Aβ1－40和 Aβ1－42

[10]。國(guó)外學(xué)者研究認(rèn)為腦內(nèi)Aβ聚集和沉淀促發(fā)炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)、神經(jīng)元纖維纏結(jié)、軸突損傷和突觸丟失，最終導(dǎo)致神經(jīng)元凋亡和發(fā)生癡呆[11]。從Aβ的產(chǎn)生、聚集和沉積再到老年斑的形成是AD的重要病理環(huán)節(jié)。因此，以Aβ為研究靶標(biāo)，降低Aβ的產(chǎn)生、抑制Aβ的聚集和沉積是預(yù)防和治療AD的有效措施，但目前抗Aβ治療還沒有上市的藥物。復(fù)方中藥具有活性成分多樣、作用靶點(diǎn)廣泛、副作用小的優(yōu)勢(shì)，因此研究復(fù)方中藥治療AD具有良好的應(yīng)用前景，已成為臨床治療老年性癡呆的重要手段。腦爾康是復(fù)方中藥制劑，由人參、川芎、生地、益智仁、冰片等組成，具有益智健腦、活血化瘀、補(bǔ)腎生髓、調(diào)養(yǎng)心神之功效。本實(shí)驗(yàn)將凝聚態(tài)Aβ1－42一次性注入大鼠海馬CA1區(qū)模擬AD病理變化，結(jié)果顯示模型組海馬區(qū)Aβ1－42的表達(dá)較空白組明顯增加（P＜0.01），并且大鼠學(xué)習(xí)記憶功能明顯受損，成功制備AD模型，利用腦爾康對(duì)AD模型大鼠灌胃干預(yù)28d后，和模型組比較，腦爾康各劑量組海馬區(qū)Aβ1－42的表達(dá)均有明顯的下調(diào)（P＜0.01），學(xué)習(xí)和記憶能力明顯改善（P＜0.01），這說明腦爾康能降低AD模型大鼠海馬區(qū)Aβ1－42的含量，并能改善其學(xué)習(xí)記憶能力。

LRP主要參與脂蛋白代謝和細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。研究發(fā)現(xiàn)，腦內(nèi)的LRP主要由神經(jīng)元產(chǎn)生，載脂蛋白E、α2巨球蛋白和LRP基因與晚發(fā)性AD相關(guān)[12]，載脂蛋白E、α2巨球蛋白都是LRP的配體，由星形膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生，胞外可溶性Aβ與載脂蛋白E、α2巨球蛋白形成復(fù)合物，再由LRP介導(dǎo)內(nèi)吞清除[2]。另外，LRP也介導(dǎo)腦內(nèi)Aβ經(jīng)血腦屏障的外流轉(zhuǎn)運(yùn)入血而清除，LRP基因缺失的AD動(dòng)物腦內(nèi)Aβ成倍增加[13]，隨年齡增長(zhǎng)，LRP表達(dá)漸進(jìn)性下降，AD患者尤其明顯，適當(dāng)上調(diào)LRP的表達(dá)，可能促進(jìn)腦內(nèi)Aβ的清除。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明腦爾康干預(yù)后，與模型組比較，腦爾康干預(yù)各組及吡拉西坦組海馬區(qū)LRP的表達(dá)明顯增加（P＜0.01或P＜0.05），腦爾康三個(gè)劑量組之間差異顯著（P＜0.05或P＜0.01），其中中藥大、中劑量組作用最為顯著；同時(shí)相應(yīng)海馬區(qū)Aβ1－42的含量較模型組下降（P＜0.01）。由此推測(cè)腦爾康可能通過上調(diào)海馬LRP的表達(dá)，降低海馬Aβ1－42的含量而發(fā)揮抗Aβ沉積作用，但確切機(jī)制有待于實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)。

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