韓 飛，楊 靜，余文富，尹一飛，武勝昔，凌樹才

(1.浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院人體解剖與細(xì)胞生物學(xué)系，浙江杭州 310058;2.衢州職業(yè)技術(shù)學(xué)院醫(yī)學(xué)院，浙江衢州 324000;3.第四軍醫(yī)大學(xué)人體解剖與組織胚胎學(xué)系，陜西西安 710032)

嗅球是脊椎動(dòng)物嗅覺信息加工處理的第一個(gè)中繼站［1］，γ-氨基丁酸(GABA)是嗅球內(nèi)一種重要的對嗅覺信息進(jìn)行抑制性調(diào)節(jié)的神經(jīng)遞質(zhì)［2］。很多學(xué)者采用抗GABA血清及抗谷氨酸脫羧酶(GAD)血清，通過免疫組織化學(xué)技術(shù)［3-4］，對其在嗅球內(nèi)分布進(jìn)行了研究并有了一定的了解，然而GABA免疫組織化學(xué)方法的結(jié)果不穩(wěn)定，而且需要對組織進(jìn)行高戊二醛固定，直接影響到對GABA免疫陽性結(jié)果的判定，也不利于開展GABA與其它神經(jīng)遞質(zhì)的共存研究。隨著生物技術(shù)及基因工程的不斷發(fā)展，GAD-GFP基因敲入小鼠逐漸被引入到GABA神經(jīng)元的研究中。GAD是GABA合成的關(guān)鍵酶，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)有不同基因編碼的GAD65與 GAD67兩種蛋白形式［5］，已有學(xué)者利用GAD65-GFP基因敲入大鼠對其在嗅球內(nèi)的分布進(jìn)行了研究［6］。但也有研究認(rèn)為，在mRNA水平小鼠嗅球中GAD67含量要比GAD65多［7］。有學(xué)者用GAD67-GFP基因敲入小鼠腦組織制作冰凍切片，分別用抗GAD67抗體與抗GFP抗體做免疫熒光實(shí)驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在有GAD67表達(dá)的部位同時(shí)有GAD67-GFP表達(dá)，且 GAD67-GFP蛋白表達(dá)的量更高［8］。因此，與直接用抗GAD67抗體檢測GAD67的分布相比，用GAD67-GFP基因敲入小鼠免疫熒光檢測GAD67-GFP的分布敏感性要更高。而且利用GAD67-GFP基因敲入小鼠可以在熒光顯微鏡下直接觀察GAD67在活細(xì)胞內(nèi)的分布，因而GAD67-GFP基因敲入小鼠已成為研究GABA的重要模式動(dòng)物，可用于各種腦片或體外培養(yǎng)細(xì)胞的研究。作者用GAD67-GFP基因敲入小鼠研究GAD67在嗅球中分布，將為深入開展上述研究提供參考依據(jù)。

一氧化氮(NO)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)重要的神經(jīng)遞質(zhì)，但NO是氣體分子，極易分解，一般是通過觀察其合成酶一氧化氮合酶(NOS)來研究NO的分布［9］。已有研究表明NO與GABA在嗅覺的高級中樞梨皮質(zhì)區(qū)神經(jīng)元內(nèi)可以共存，且認(rèn)為NO在功能上與 GABA有協(xié)同作用［10］。GABA與NO也是嗅球內(nèi)的重要神經(jīng)遞質(zhì)，但兩者在嗅球內(nèi)是否有共存關(guān)系及功能上是否存在協(xié)同作用還未見相關(guān)報(bào)道，因此作者也將進(jìn)行一些探索。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 NP40(鼎國生物技術(shù)有限責(zé)任公司)，Tween20(武漢博士德生物工程有限公司)，Takara rTaq(Takara)，50*TAE(上海生工)，山羊血清(購于武漢博士德生物工程有限公司)，BSA(武漢博士德生物工程有限公司)，Trizol(武漢博士德生物工程有限公司)，mouse anti-GFP(CHEMICON)，Rabbit anti-bNOS(SIGMA)，goat-anti-mouse FITC(SIGMA)，goatanti-Rabbit Biosin(SIGMA)，Andisin anti-Biosin TRITC(SIGMA)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 GAD67-GFP基因敲入C57BCL/6小鼠(第四軍醫(yī)大學(xué)武勝昔教授惠贈(zèng))，成年，雄性，20～25 g，室溫保持在 18～23℃，自然光周期12 h亮/暗交替，充足的水和飼料。

1.3 基因型鑒定

1.3.1 抽提動(dòng)物組織基因組 由于校外引進(jìn)的GAD 67-GFP基因敲入小鼠數(shù)量有限，本實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行了繁殖及基因型鑒定。剪取小鼠尾巴組織約5 mg，置組織于100 ml組織細(xì)胞裂解液中并加入1μL proteinase k ，55°水浴中12 h，輕搖溶解組織，沸水中煮5 min，12 000 r/min離心2 min。基因組DNA懸浮于上清液中。

1.3.2 PCR反應(yīng) 上游引物CTTgTACAgCTCg TCCATgC，下游引物:ATggTgAgCAAgggCgA ggA，25μL反應(yīng)體系:DDW 18.25μL，10*PCR Buffer(含 Mg 離子)2.5μL，dNTP Mix 2μL，上、下游引物(20 μmol/L)各 0.5μL，Takarar Taq 0.25μL，按以上順序依次加入其中。之后放入PCR儀中，退火溫度設(shè)為58℃，共30個(gè)循環(huán)。

1.3.3 瓊脂糖凝膠電泳 40 ml 1*TAE加入400 μg瓊脂糖微波爐中煮沸溶解至溶液澄清，室溫放置10 min，加入核酸染料 EB 2μL，待其凝固后放入電泳槽中，100 V電泳30 min。

1.4 Nissl染色觀察嗅球各層細(xì)胞分布

1.4.1 冰凍切片 復(fù)合麻藥腹腔麻醉(3 ml/100 g)，開胸暴露心臟，左心室插管并剪開右心耳放血，生理鹽水灌注沖血至肝臟完全變蒼白(約3～5 min)，之后換用4%多聚甲醛溶液灌注固定持續(xù)30 min左右，取嗅球用冰凍切片機(jī)(Leica CM1900)沿嗅球冠狀切面做20 μm厚連續(xù)切片，并用明膠包被預(yù)處理的載玻片貼片。

1.4.2 Nissl染色 將制備好的嗅球冠狀切片烘干，經(jīng)梯度酒精脫脂雙蒸水清洗后，在0.1%的焦油紫溶液中浸染5 min，取出切片雙蒸水沖洗，最后經(jīng)梯度酒精脫水、二甲苯透明后，在激光共聚焦熒光顯微鏡下觀察。

1.5 免疫熒光觀察GABA在嗅球各細(xì)胞層的分布及bNOS的共存 將制備好的冰凍切片置于37℃烘箱中干燥30 min，將封閉液滴加在組織切片上，于37℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育1 h，以封閉非特異性抗原。將孵育后的切片取出并甩干封閉液，分別加入一抗 mouse anti-GFP與Rabbit anti-bNOS，濕盒中4℃冰箱保存72 h，取出并用0.01 mol/L PBS于搖床上清洗3次，5 mins/次，之后分別加入二抗 goat-anti-mouse FITC、goat-anti-Rabbit Biotin，濕盒中 4℃冰箱保存48 h，取出切片同樣PBS洗滌三次。將單標(biāo)GFP的切片加少量DAPI染色反應(yīng)1～2 min后，輕輕甩干并用熒光封片劑封片。剩下bNOS切片需要加入三抗Andisin anti-Biosin TRITC，濕盒4℃冰箱反應(yīng)24 h，同樣洗滌、DAPI染色及熒光封片劑封片。最后激光共聚焦熒光顯微鏡下觀察組織切片染色結(jié)果。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析 隨機(jī)選取3張切片，其中同一張切片中分別隨機(jī)選取嗅球各細(xì)胞層單位面積圖片6張，利用軟件Image tool對單位面積的細(xì)胞數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。利用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件對得出的細(xì)胞個(gè)數(shù)再進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果

2.1 基因型鑒定結(jié)果 PCR反應(yīng)產(chǎn)物做瓊脂糖凝膠電泳，GAD 67-GFP基因敲入小鼠在750bp處出現(xiàn)條帶，非GAD 67-GFP基因敲入小鼠在750 bp處不會(huì)出現(xiàn)條帶。由電泳結(jié)果圖可以斷定第4、5、7泳道對應(yīng)為GAD 67-GFP基因敲入小鼠，第6泳道對應(yīng)為非GAD 67-GFP基因敲入小鼠(如圖1所示)。

2.2 Nissl染色結(jié)果 嗅球由前向后連續(xù)冠狀面切片。如圖2中所示:選取嗅球的前部、中部、后部典型的Nissl染色切片，在激光共聚焦顯微鏡下觀察可知嗅球整體結(jié)構(gòu)及細(xì)胞排列方面，前部與中部基本沒有發(fā)生非常明顯的變化，在后部嗅球切片中央偏后的部位出現(xiàn)了副嗅球(AOB)結(jié)構(gòu);在大部分嗅球切片中，均有3層細(xì)胞分布密集的細(xì)胞層組成，由外向內(nèi)依次為球旁細(xì)胞層、僧帽細(xì)胞層及顆粒細(xì)胞層，其中位于顆粒細(xì)胞層與僧帽細(xì)胞層之間僅有少量的細(xì)胞分布的區(qū)域?yàn)橥鈪矤顚樱饕植贾窠?jīng)元的軸突、樹突及它們相互之間形成的突觸。

2.3 免疫熒光標(biāo)記結(jié)果

2.3.1 GAD 67陽性細(xì)胞在嗅球各細(xì)胞層的分布(圖3)及其比例(圖4) 如圖所示，GAD 67陽性細(xì)胞在嗅球顆粒細(xì)胞層由較高的分布比例，而在嗅小球?qū)觾?nèi)的每個(gè)小球結(jié)構(gòu)周邊均間或有GAD 67陽性細(xì)胞，與嗅小球?qū)酉啾人技?xì)胞比例要小很多，而在僧帽細(xì)胞層GAD 67陽性細(xì)胞僅有極少分布。結(jié)合DAPI進(jìn)行嗅球內(nèi)神經(jīng)元的染色，可以推算出GAD 67陽性細(xì)胞在嗅球各細(xì)胞層的分布比例(圖4)。

2.3.2 bNOS在嗅球各細(xì)胞層的分布及與GAD 67的共存(圖5)bNOS陽性染色細(xì)胞在球旁細(xì)胞層和僧帽細(xì)胞層均有分布，其中在僧帽細(xì)胞層分布較多。GFP標(biāo)記的GAD 67與bNOS在顆粒細(xì)胞層及僧帽細(xì)胞層未發(fā)現(xiàn)有共存，而在嗅小球偶見二者共存。

3 討論

GAD65/67是GABA合成的關(guān)鍵酶。有學(xué)者利用基因敲除的方法把GAD65基因片段敲除掉，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在GABA含量及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物行為學(xué)方面沒有發(fā)生變化;而在GAD67基因片段敲除掉后GAD活性與GABA含量均發(fā)生了明顯的減少［11］，因此在中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)，GAD67可能具有更重要的生理功能和意義。本研究利用GAD 67-GFP基因敲入小鼠，詳細(xì)分析了GAD 67陽性細(xì)胞在嗅球各層的分布，結(jié)果表明GAD67在球旁細(xì)胞層與顆粒細(xì)胞層均具有較高的分布密度，說明嗅覺信息傳遞過程中的反饋抑制主要發(fā)生在這兩層中。有研究表明在小鼠神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)，GAD67表達(dá)量的變化更容易受到外界環(huán)境的變化及神經(jīng)活動(dòng)的影響，相對于GAD65而言具有更高的可塑性［12］。因此，在研究各種生理或病理?xiàng)l件下GABA含量所發(fā)生的改變時(shí)，GAD 67-GFP基因敲入小鼠往往作為首選的模型動(dòng)物。bNOS在脊椎動(dòng)物嗅覺信息的傳遞中起著非常重要的作用［13］，與嗅覺的學(xué)習(xí)記憶的形成亦密切的聯(lián)系［14］。有大鼠嗅球研究表明，bNOS主要分布在球旁細(xì)胞層、顆粒細(xì)胞層和僧帽細(xì)胞［15］。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)小鼠嗅球僧帽細(xì)胞層與球旁細(xì)胞層中，bNOS為強(qiáng)陽性表達(dá)而在顆粒細(xì)胞層未發(fā)現(xiàn)有大量表達(dá)。而GAD 67與bNOS的共存經(jīng)本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)主要集中在嗅小球?qū)印?/p>

神經(jīng)遞質(zhì)共存的研究常被用來探討神經(jīng)元功能以及神經(jīng)遞質(zhì)之間的交互作用，有十分重要的價(jià)值和意義［16］。神經(jīng)細(xì)胞的分類常以其所含的神經(jīng)遞質(zhì)來進(jìn)行分類，并且還可以根據(jù)該神經(jīng)元所含的其他神經(jīng)遞質(zhì)不同進(jìn)一步分為亞細(xì)胞類型［17］。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn) GAD 67與bNOS共存于部分嗅小球?qū)由窠?jīng)元。已經(jīng)有實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)bNOS過度釋放會(huì)通過NMDA受體通路誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞毒性［18］。既然 GAD 67與bNOS共存于嗅小球?qū)由窠?jīng)元，在神經(jīng)元被激活時(shí)GABA的大量釋放是否會(huì)通過NO途徑引起神經(jīng)毒性，或者說GABA與bNOS的釋放在時(shí)間和空間上是否存在協(xié)同作用或是拮抗作用。GAD 67參與合成的GABA對于嗅覺信息的傳入起著抑制性調(diào)節(jié)作用［19］，而一氧化氮在學(xué)習(xí)記憶中起著重要作用［20］在同一神經(jīng)元內(nèi)GABA的釋放是否與NO通路形成的嗅覺學(xué)習(xí)記憶有密切關(guān)系GABA的大量釋放是否會(huì)通過NO途徑引起神經(jīng)毒性?這一些列問題還有待研究。隨著神經(jīng)科學(xué)飛速發(fā)展，神經(jīng)遞質(zhì)共存的研究及其價(jià)值的體現(xiàn)將會(huì)越來越深遠(yuǎn)和廣泛。

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