薛生國(guó)，劉豐豪，吳川，黃艷紅，吳超

(1. 中南大學(xué) 冶金科學(xué)與工程學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙，410083;2. 中南大學(xué) 資源與安全工程學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙，410083)

在植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中，微量元素具有極其重要的作用。錳是植物生長(zhǎng)必需的微量營(yíng)養(yǎng)元素之一，它可提高碳水化合物的同化作用和呼吸強(qiáng)度，促進(jìn)酶的活性，影響氮的代謝[1]。它在植物體中含量過(guò)高或過(guò)低，都將制約植物生長(zhǎng)。在正常情況下，植物對(duì) Mn的吸收主要為受代謝控制的主動(dòng)吸收過(guò)程。Mn2+是植物吸收錳的主要形態(tài)，此外，還有植物和微生物來(lái)源的含錳絡(luò)合物和螯合物。Sadana等[2]的研究表明：控制植物吸收錳的主要因素是生長(zhǎng)介質(zhì)中錳的初始濃度、最大吸收速率和米氏常數(shù)等。植物吸收Mn的速率不僅受環(huán)境因素(如生長(zhǎng)介質(zhì)中Mn的含量、溫度、pH等)的影響，而且與植物的生長(zhǎng)發(fā)育狀況(如生育期和代謝強(qiáng)度等)密切相關(guān)，這些因素之間的關(guān)系錯(cuò)綜復(fù)雜，共同影響著植物對(duì) Mn2+吸收和積累。垂序商陸(Phytolacca americana Linn.)屬于商陸科多年生草本植物，是一種生物量大、生長(zhǎng)快、地理分布廣、適應(yīng)性強(qiáng)的錳超富集植物[3?5]，不僅具有極強(qiáng)的耐高錳脅迫能力，還具有很強(qiáng)的吸收和運(yùn)輸錳的能力，其地上部分(葉片、莖)錳濃度大于根系的濃度，錳耐性和超富集能力可能是其固有特性，不同種群之間差異甚小[6]，這為探討錳在植物體中的超富集機(jī)理和錳污染土壤和水體的植物修復(fù)提供了一種新的種質(zhì)資源。目前，對(duì)錳超富集植物研究報(bào)道較少[4,6?11]，影響垂序商陸錳吸收和積累過(guò)程的內(nèi)外因素并不十分清楚。多種因素影響植物對(duì)元素的吸收，如光照、溫度、水分、pH、生長(zhǎng)介質(zhì)中的元素含量，在此，本文作者擬采用溫室試驗(yàn)，研究溫室培養(yǎng)條件和不同錳濃度下垂序商陸的錳吸收動(dòng)態(tài)及錳脅迫水平對(duì)其吸收和積累錳的影響，揭示超富集植物垂序商陸對(duì)錳的吸收和積累特性，以期為開(kāi)發(fā)利用該植物修復(fù)錳污染環(huán)境提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

超富集植物垂序商陸的種子采自湖南省湘潭錳尾礦廢棄地成熟的植株。

1.2 溫室試驗(yàn)

人工智能溫室內(nèi)控制植物生長(zhǎng)環(huán)境：14 h光照，溫度為 25 ℃(白天)/20 ℃(晚上)，相對(duì)濕度為 70%～75%。將垂序商陸種子播于消毒的沙基質(zhì)，萌芽后選取生長(zhǎng)一致的垂序商陸幼苗，依次在0.25 Hoagland營(yíng)養(yǎng)液和0.50 Hoagland營(yíng)養(yǎng)液預(yù)培養(yǎng)15 d，移至外壁涂黑的塑料桶，在不同錳濃度條件下進(jìn)行錳吸收試驗(yàn)。Mn2+以MnCl2·4H2O形態(tài)加入，每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)。短期錳吸收動(dòng)態(tài)(48 h)設(shè)定2種處理方式，即Mn2+的濃度分別為0.2和5.0 mmol/L,分別于0，2，4，8，16，32和48 h取樣；長(zhǎng)期錳吸收動(dòng)態(tài)(45 d)設(shè)定2種處理方式，即Mn2+的濃度分別為0.5和5 mmol/L，分別于第0，5，15，25，35和45天取樣。另外，設(shè)定8種處理方式，即Mn2+的濃度分別為0.005 (CK)，0.5，1.0，2.0，5.0，8.0，10.0和12.0 mmol/L，分別于第0，5，15，25，35和45 天取樣，研究不同錳濃度下垂序商陸錳積累的動(dòng)態(tài)變化。樣品根部用流動(dòng)的自來(lái)水沖洗10 min，再用去離子水沖洗3次，用吸水紙把表面水吸干。將樣品分為根、莖、葉，測(cè)定各部分質(zhì)量。將新鮮樣品放在105 ℃的烘箱內(nèi)保持30 min，然后在70℃下烘48 h，測(cè)定植物各部分干物質(zhì)量；最后用不銹鋼粉碎機(jī)磨細(xì)，過(guò)孔徑為0.38 mm尼龍網(wǎng)篩，供分析測(cè)定用。

1.3 植物樣品分析

稱(chēng)取烘干植物樣品約0.15 g，采用濕法消化(混合酸 15 mL HNO3+5 mL HCl+2 mL HClO4)，用 ICP/OES法(IRIS/AP，USA，Thermo Jarrell Ash)測(cè)定垂序商陸植物體內(nèi)錳元素含量。

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Microsoft Office Excel 2010進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 垂序商陸對(duì)錳吸收和積累隨時(shí)間變化的短期動(dòng)態(tài)特征

垂序商陸對(duì)錳吸收和積累隨時(shí)間變化的短期動(dòng)態(tài)特征如圖1所示。

從圖1可見(jiàn)：在低錳濃度(0.2 mmol/L)條件下，垂序商陸葉對(duì)錳的吸收隨時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸增加；在 2 h時(shí)錳含量變化不大，此后逐漸升高，在8 h時(shí)趨勢(shì)變緩，32 h時(shí)繼續(xù)增加，至48 h時(shí)達(dá)到704 mg/kg；垂序商陸莖對(duì)錳的吸收隨時(shí)間緩慢增加，至16 h時(shí)達(dá)到近飽和狀態(tài)，48 h時(shí)達(dá)到1.294 g/kg。垂序商陸根對(duì)錳的吸收隨時(shí)間逐漸增加，在4 h內(nèi)錳含量變化不大，此后逐漸升高；在32 h時(shí)趨于飽和狀態(tài)，至48 h時(shí)達(dá)到1.251 g/kg。

在生長(zhǎng)介質(zhì)高錳濃度(5.0 mmol/L)條件下，垂序商陸葉對(duì)錳的吸收同樣隨時(shí)間的延長(zhǎng)增大，但變化趨勢(shì)與低錳濃度時(shí)存在差異。在2 h時(shí)變化不大，此后緩慢升高，從16 h開(kāi)始急劇增加，直至48 h達(dá)到5.068 g/kg；垂序商陸莖對(duì)錳的吸收同樣隨時(shí)間增加，經(jīng)過(guò)一個(gè)極短的適應(yīng)期后就開(kāi)始急劇增加，直至48 h達(dá)到4.008 g/kg；垂序商陸根對(duì)錳的吸收同樣隨時(shí)間增大，但變化趨勢(shì)與低錳濃度時(shí)存在差異。在2 h內(nèi)錳吸收急劇增加，此后經(jīng)過(guò)一段平緩期，再次持急劇增加，16 h后開(kāi)始緩慢升高，直至48 h達(dá)到4.060 g/kg。

圖1 48 h時(shí)垂序商陸葉、莖和根錳吸收的短期變化動(dòng)態(tài)Fig.1 Manganese uptake in leaves, stems and roots of P. americana of different time in 48 h

2.2 垂序商陸對(duì)錳吸收和積累隨時(shí)間變化的長(zhǎng)期動(dòng)態(tài)特征

垂序商陸對(duì)錳吸收和積累隨時(shí)間變化的長(zhǎng)期動(dòng)態(tài)特征如圖2所示。

從圖2可見(jiàn)：在錳濃度為0.5 mmol/L時(shí),垂序商陸葉錳含量第5天便升至4.442 g/kg，第15 天降至3.306 g/kg；隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，第45 天時(shí)錳含量又升至9.034 g/kg；莖中錳含量則隨著植物的生長(zhǎng)升高，第45 天時(shí)達(dá)到 1.609 g/kg；根的錳含量變化差異不明顯，生長(zhǎng)15 d后升高至2.352 mg/kg,然而，第35天降至1.517 mg/kg，第45天又增加至2.335 g/kg，與生長(zhǎng)15 d的垂序商陸莖錳含量持平。

圖2 45 d時(shí)垂序商陸葉、莖和根錳吸收的長(zhǎng)期變化動(dòng)態(tài)Fig.2 Manganese uptake in leaves, stems and roots of P.americana of different time in 45 d

在生長(zhǎng)介質(zhì)高錳濃度(5.0 mmol/L)下，垂序商陸葉的錳含量呈現(xiàn)波動(dòng)性變化，生長(zhǎng) 5 d后即達(dá)到 34.5 g/kg，25 d后降至20.27 g/kg，最后隨著植物的生長(zhǎng)又升至30.69 g/kg；莖錳和根錳含量分別與生長(zhǎng)介質(zhì)低錳濃度時(shí)的植物體錳含量變化狀態(tài)相似，莖錳含量隨時(shí)間持續(xù)升高，至45 d時(shí)達(dá)到8.899 g/kg；而根錳含量則在生長(zhǎng)15 d時(shí)達(dá)到最高5.948 g/kg，其后有所降低，但隨不同時(shí)間植物體錳含量變化差異不明顯。

2.3 垂序商陸的錳吸收隨生長(zhǎng)介質(zhì)錳濃度變化的動(dòng)態(tài)特征

垂序商陸的錳吸收隨生長(zhǎng)介質(zhì)錳濃度變化的動(dòng)態(tài)特征見(jiàn)圖3。從圖3可見(jiàn)：垂序商陸葉錳含量隨著錳處理濃度的升高而增加，當(dāng)錳濃度達(dá)到5.0 mmol/L時(shí)增加態(tài)勢(shì)變緩，葉錳含量變化不大。然而，當(dāng)植物生長(zhǎng)5 d時(shí)，葉錳含量變化趨勢(shì)有所差異，當(dāng)錳處理濃度5.0 mmol/L 時(shí)垂序商陸葉錳含量高達(dá)34.5 g/kg，其后先降低，當(dāng)錳濃度為 12.0 mmol/L 時(shí)又升高到35.77 g/kg。

圖3 垂序商陸葉、莖和根錳吸收隨生長(zhǎng)介質(zhì)錳濃度變化的動(dòng)態(tài)特征Fig.3 Manganese uptake in leaves, stems and roots of P. americana as a function of Mn concentrations

不同生長(zhǎng)時(shí)期的垂序商陸莖錳含量均隨生長(zhǎng)介質(zhì)中錳濃度的升高而增加，當(dāng)垂序商陸在錳濃度為12.0 mmol/L的營(yíng)養(yǎng)液中生長(zhǎng)45 d時(shí)，錳含量高達(dá)12.86 g/kg。垂序商陸在不同生長(zhǎng)時(shí)期的根錳含量與莖錳含量變化趨勢(shì)相似，均與生長(zhǎng)介質(zhì)錳含量成正比。當(dāng)垂序商陸在錳濃度為 12.0 mmol/L 的生長(zhǎng)介質(zhì)中培養(yǎng)5 d時(shí)，錳含量高達(dá)11.5 g/kg。然而，隨著植物的生長(zhǎng)，垂序商陸根錳含量呈現(xiàn)出先降低后升高的趨勢(shì)。垂序商陸生長(zhǎng)25 d時(shí)根錳含量降至8.215 g/kg，培養(yǎng)45 d后根錳含量又增加到10.400 g/kg。在其他錳濃度下，垂序商陸根錳含量也有相似的變化趨勢(shì)。

3 討論

超富集植物從根際吸收重金屬，并將其轉(zhuǎn)移和積累到地上部分，這過(guò)程包括許多環(huán)節(jié)和調(diào)控位點(diǎn)，包括根際重金屬的活化、跨根細(xì)胞膜運(yùn)輸、根皮層細(xì)胞橫向運(yùn)輸、從根系的中柱薄壁細(xì)胞裝載到木質(zhì)部導(dǎo)管、木質(zhì)部中長(zhǎng)途運(yùn)輸，從木質(zhì)部卸載到葉細(xì)胞、跨葉細(xì)胞膜運(yùn)輸、跨葉細(xì)胞的液泡膜運(yùn)輸，其中金屬離子的跨膜運(yùn)輸是一個(gè)極其重要的調(diào)控機(jī)制[12]。在溫室培養(yǎng)下，生長(zhǎng)介質(zhì)(營(yíng)養(yǎng)液)中金屬的活度高，不存在金屬的活化過(guò)程，控制植物體內(nèi)金屬積累的第1步是金屬的跨根細(xì)胞膜運(yùn)輸，它決定于金屬跨根細(xì)胞的內(nèi)流(influx)和外流(efflux)之間的動(dòng)態(tài)平衡。從垂序商陸對(duì)錳吸收隨時(shí)間變化的動(dòng)態(tài)結(jié)果來(lái)看(見(jiàn)圖1和圖2)：在生長(zhǎng)介質(zhì)高M(jìn)n2+濃度(5.0 mmol/L)下，根系Mn含量隨著生長(zhǎng)時(shí)間增加較快，而在低Mn2+濃度(0.2和0.5 mmol/L)下，根系Mn含量隨著生長(zhǎng)時(shí)間變化不大。這說(shuō)明在生長(zhǎng)介質(zhì)Mn濃度高時(shí)，Mn跨根細(xì)胞的內(nèi)流速率大于外流速率，導(dǎo)致根系Mn含量不斷增加；而在低Mn濃度下，通過(guò)預(yù)培養(yǎng)后，Mn跨根細(xì)胞膜的內(nèi)流與外流正趨于動(dòng)態(tài)平衡，從而根系Mn含量隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)增加較少。超富集植物根系重金屬含量隨著生長(zhǎng)介質(zhì)中重金屬濃度的增加而增加，這與龍新憲[12]的研究結(jié)果一致。盡管垂序商陸根系Mn的內(nèi)流速率隨著Mn濃度的增加而增加，但是，還無(wú)法確定這種凈內(nèi)流增加的原因是主動(dòng)吸收還是被動(dòng)吸收，這有待于進(jìn)一步研究。

超富集植物不僅應(yīng)有超常的重金屬吸收和積累能力，而且能將其轉(zhuǎn)移并貯存在地上部分。在低錳濃度(0.2 mmol/L)條件下，垂序商陸葉對(duì)錳的吸收隨時(shí)間逐漸增加，而垂序商陸莖和根對(duì)錳的吸收隨時(shí)間緩慢增加，分別在16 h和32 h時(shí)趨于飽和狀態(tài)(圖1)。而在高錳濃度(5.0 mmol/L )條件下，垂序商陸葉、莖和根系對(duì)錳的吸收均隨時(shí)間增加，這表明垂序商陸根系吸收的錳向地上部轉(zhuǎn)運(yùn)受生長(zhǎng)介質(zhì)中 Mn濃度和體內(nèi)Mn狀況的雙重控制。但是，垂序商陸48 h內(nèi)沒(méi)有趨于飽和的趨勢(shì)，沒(méi)發(fā)現(xiàn)類(lèi)似的“飽和極限”，這與超富集植物東南景天的研究結(jié)果不一致[12]，其原因有待深入探討。通過(guò)對(duì)模式植物遏藍(lán)菜(Thlaspi caerulescens)超富集Zn的生理和分子機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)：Zn跨膜運(yùn)輸受膜運(yùn)輸?shù)鞍椎恼{(diào)控，超富集植物的根系和地上部分Zn運(yùn)輸?shù)鞍椎幕虮磉_(dá)豐度比非超富集植物的高，其表達(dá)豐度受生長(zhǎng)介質(zhì)中Zn濃度和植物組織內(nèi)Zn狀況調(diào)控[13?14]。垂序商陸體內(nèi)是否也存在類(lèi)似的Mn運(yùn)輸?shù)鞍?，其表達(dá)豐度是否同樣受生長(zhǎng)介質(zhì)中Mn濃度和植物組織內(nèi)Mn狀況雙重影響，還有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

(1) 垂序商陸根、莖和葉的錳含量基本隨著生長(zhǎng)介質(zhì)錳濃度的升高而增加；在不同錳濃度下，垂序商陸根、莖和葉錳含量均隨著生長(zhǎng)時(shí)間呈現(xiàn)波動(dòng)變化。

(2) 在生長(zhǎng)介質(zhì)不同錳濃度下，垂序商陸根、莖和葉錳含量在植物處理5 d時(shí)出現(xiàn)1個(gè)峰值，其后有所降低；垂序商陸在錳處理開(kāi)始的48 h內(nèi)存在一個(gè)快速的吸收過(guò)程，但是高錳濃度變化幅度要大于低錳濃度時(shí)的變化幅度。

(3) 垂序商陸對(duì)錳的吸收和積累模式依賴(lài)于生長(zhǎng)介質(zhì)中錳的濃度和時(shí)間，這表明超富集植物垂序商陸對(duì)錳的吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)受生長(zhǎng)介質(zhì)錳濃度和植物體內(nèi)錳含量狀況雙重控制。

[1]Baker A J M, Brooks R R. Terrestrial higher plants which hyperaccumulate metal elements: A review of their distribution,ecology, and phytochemistry[J]. Biorecovery, 1989, 1(2):81?126.

[2]Sadana U S, Claassen N. Manganese dynamics in the rhizosphere and Mn uptake by different crops evaluated by a mechanistic model[J]. Plant and Soil, 2000, 218(1): 233?238.

[3]薛生國(guó), 陳英旭, 林琦, 等. 中國(guó)首次發(fā)現(xiàn)的錳超積累植物-商陸[J]. 生態(tài)學(xué)報(bào), 2003, 23(5): 935?937.XUE Sheng-guo, CHEN Ying-xu, LIN Qi, et al. Phytolacca acinosa Roxb. (Phytolaccaceae): A new manganese hyperaccumulator plant from Southern China[J]. Acta Ecological Sinica, 2003, 23(5): 935?937.

[4]Xue S G, Chen Y X, Reeves R D, et al. Manganese uptake and accumulation by the hyperaccumulator plant Phytolacca americana Roxb. (Phytolaccaceae)[J]. Environmental Pollution,2004, 131(3): 393?399.

[5]XUE Sheng-guo, WANG Jun, ZHOU Xiao-hua, et al. A critical reappraisal of Phytolacca acinosa Roxb. (Phytolaccaceae)-a manganese-hyperaccumulating plant[J]. Acta Ecologic Sinica,2010, 30(6): 335?338.

[6]Xue S G, Chen Y X, Baker A J M, et al. Manganese uptake and accumulation by two populations of Phytolacca acinosa Roxb.(Phytolaccaceae)[J]. Water Air and Soil Pollution, 2005,160(1/3): 3?14.

[7]Bidwell S D, Woodrow I E, Batianoff G N, et al.Hyperaccumulation of manganese in the rainforest tree Austromyrtus bidwillii (Myrtaceae) from Queensland,Australia[J]. Functional Plant Biology, 2002, 29(7): 899?905.

[8]Fernando D R, Bakkaus E J, Perrier N, et al. Manganese accumulation in the leaf mesophyll of four tree species: A PIXE/EDAX localization study[J]. New Phytologist, 2006,171(4): 751?758.

[9]XU Xiang-hua, SHI Ji-yan, CHEN Xin-cai, et al. Chemical forms of manganese in the leaves of manganese hyperaccumulator Phytolacca acinosa Roxb (Phytolaccaceae)[J].Plant and Soil, 2009, 318(1/2): 197?204.

[10]梁文斌, 薛生國(guó), 沈吉紅, 等. 錳脅迫對(duì)垂序商陸葉片光合特性及葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響[J]. 生態(tài)學(xué)報(bào), 2010, 30(3):619?625.LIANG Wen-bin, XUE Sheng-guo, SHEN Ji-hong, et al. Effect of manganese stress on photosynthesis and chlorophyll fluorescence parameters of Phytolacca americana[J]. Acta Ecological Sinica, 2010, 30(3): 619?625.

[11]薛生國(guó), 周曉花, 劉恒, 等. 垂序商陸對(duì)污染水體重金屬去除潛力的研究[J]. 中南大學(xué)學(xué)報(bào): 自然科學(xué)版,2011,42(4):1156-1160.XUE Sheng-guo, ZHOU Xiao-hua, LIU Heng, et al. The potential of Phytolacca americana for removal of heavy metals from contaminated waters[J]. Journal of Central South University: Science and Technology, 2011, 42(4): 1156-1160.

[12]龍新憲. 東南景天對(duì)鋅的耐性和超富集機(jī)制研究[D]. 杭州:浙江大學(xué)環(huán)境與資源學(xué)院, 2002: 81?94.LONG Xin-xian. Tolerance and hyperaccumulation mechanism of Sedum alfredii Hance to Zn[D]. Hangzhou University.College of Resource and Environmental Sciences, 2002: 81?94.

[13]Lasat M M, Pence N S, Garvin D F, et al. Molecular physiology of zinc transport in the Zn hyperaccumulator Thlaspi caerulescens[J]. Journal of Experimental Botany, 2000, 51(342):71?79.

[14]Assuncao A G L, Costa Martins P D A, Foleter S D E, et al.Elevated expression of metal transporter genes in three accessions of the metal hyperaccumulator Thlaspi caerulescens[J]. Plant Cell and Environment, 2001, 24(2):217?226.