楊萬政 蒲維維 白音夫 王 捷

(1.中央民族大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，北京100081;2.中國氣象局北京城市氣象研究所，北京100089;3.內(nèi)蒙古自治區(qū)中蒙醫(yī)研究所，內(nèi)蒙古呼和浩特010020;4.內(nèi)蒙古宇航人高技術(shù)產(chǎn)業(yè)有限責(zé)任公司，內(nèi)蒙古呼和浩特011517)

清喉顆粒由金銀花、牛蒡子、玄參、沙棘等7味藥材組成的蒙藥，具有清透熱邪、利咽散結(jié)之功效。為提高中藥保健品的質(zhì)量，對其制備工藝條件進(jìn)行了研究和考察。本文分別采用HPLC法河分光光度法，分別以溶媒、醇濃度、料液比、提取時(shí)間、提取次數(shù)和浸泡時(shí)間6個(gè)單因素來考察清喉顆粒的提取工藝。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，綠原酸的分析方法有薄層掃描法［1，2］、高效液相色譜法［3，4］、分光光度法［5，6］等;牛蒡子苷的測定方法有高效液相色譜法［7，8］和薄層掃描法［9］等?？傸S酮的分析方法一般采取分光光度法［10，11］。

1 材料與儀器

1.1 藥材:金銀花、薄荷、牛蒡子、玄參、蘆根購于北京同仁堂藥店;沙棘購于水利部高原圣果有限公司;余甘子購于西藏藥廠。

1.2 儀器:LC10－ADvp型高效液相色譜儀;V－550紫外可見分光光度計(jì);Millipore純水機(jī);Adventurer電子分析天平。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)品:綠原酸標(biāo)、牛蒡子苷、蘆丁購于中國藥品生物制品檢定所。(標(biāo)準(zhǔn)品批號)

1.4 試劑:甲醇、乙腈、磷酸均為色譜純，其余試劑為分析純。

2 實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果

2.1 含量測定方法

2.1.1 綠原酸的含量測定:色譜條件:色譜柱 以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑;檢測波長327nm;流動(dòng)相 乙腈－水(20:80)，磷酸調(diào)節(jié) pH=4;流速 1mL·min－1;柱溫30℃;分別準(zhǔn)確移取濃度為8.5 mL的綠原酸對照品溶液0.5、1、2、4、6、8(mL)于 10mL 容量瓶中，用 50%甲醇稀釋至刻度，各取20μL稀釋液進(jìn)樣，在上述色譜條件下測定峰面積。以峰面積為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，直線回歸得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為:y=54645x–122210，R2=0.9997。結(jié)果表明綠原酸進(jìn)樣濃度在8.5～68μg·mL－1范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

取樣品溶液1mL，用50%甲醇定容至10mL，過微孔濾膜，所得濾液為供試品溶液。在上述色譜條件下，取20?l進(jìn)樣測定峰面積。由標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算樣品溶液中綠原酸的含量。

2.1.2 牛蒡子苷的含量測定:色譜條件:色譜柱 以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑;流動(dòng)相乙腈－水(30:70);流速1mL·min－1;檢測波長 278nm;柱溫30℃;

分別準(zhǔn)確移取濃度為 8.7μg·mL－1對照品溶液 0.25、0.5、1、2、4、6、8(mL)于 10mL 容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，各取20μL稀釋液進(jìn)樣，在上述色譜條件下測定峰面積。以峰面積為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，直線回歸得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為:y=11918x －2845.6，R2=0.9996。結(jié)果表明牛蒡子苷進(jìn)樣濃度在 2.175 ～69.600μg·mL－1范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

取樣品溶液1mL，用甲醇定容至10mL，過微孔濾膜，所得濾液為供試品溶液。在上述色譜條件下，取20μL進(jìn)樣測定峰面積。由標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算樣品溶液中牛蒡子苷的含量。

2.1.3 總黃酮的含量測定:精確稱取6.1mg蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇溶解，定容到250mL容量瓶中，備用。分別準(zhǔn)確移取以上述對照品溶液 5、7、9、11、13、15(mL)于 25mL 容量瓶中，加5%AlCl3甲醇溶液1mL，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，靜置 10min。

以吸光度值為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，直線回歸得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為:y=0.0522x+0.0275，R2=0.9999。結(jié)果表明總黃酮濃度在4.880 ～14.640μg·mL－1范圍內(nèi)與吸光度線性關(guān)系良好。

取1mL樣品溶液于25mL容量瓶中，加入1mL 5%AlCl3甲醇溶液，再加入甲醇定容，靜置10min，進(jìn)行測定，以標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算樣品含量。

2.2 提取工藝單因素考察

有效成分得率=nCV/M×100% 其中:n為提取液稀釋倍數(shù);C為提取液中有效成分濃度，mg·mL－1;V為提取液體積，mL;M為藥材的重量，g。

綜合評分:因金銀花為方中君藥，綠原酸為金銀花的主要有效成分，具有較高的藥理活性，故綠原酸為重要指標(biāo)之一，權(quán)重系數(shù)定為0.4。牛蒡子苷為牛蒡子的有效成分，且牛蒡子為方中臣藥，因此，牛蒡子苷作為評價(jià)提取工藝的一個(gè)指標(biāo)，權(quán)重系數(shù)定為0.3。作為大類成分間接控制的一個(gè)指標(biāo)，總黃酮的權(quán)重系數(shù)定為0.3。

2.2.1 溶媒:取2份等量藥材，分別加入10倍量水和10倍量70%乙醇，各提取1次，1h/次。將提取液過濾，濃縮并定容，得供試品液。按評價(jià)指標(biāo)測定方法分別測定綠原酸、總黃酮、牛蒡子苷含量，計(jì)算有效成分得率。

表1 藥材提取效率

由表1可見，醇提液比水提液的有效成分得率高，且水的極性大，易提取出果膠、黏液質(zhì)、色素等多種雜質(zhì)，使得提取液難于過濾、易于霉變、不易儲(chǔ)藏，故選擇乙醇為提取溶劑。

2.2.2 乙醇濃度:取5份等量藥材，分別加入10倍量的50、60、70、80、90(%)乙醇，各浸泡2h，提取1 次，1h/次。將提取液過濾、濃縮后定容，得供試品液。按前述方法分別測定綠原酸、總黃酮和牛蒡子苷含量，計(jì)算有效成分得率。

從圖1中可看出，70%的乙醇對綠原酸和牛蒡子苷都有較好的提取效果，而60%的乙醇則更適宜黃酮類化合物的提取。通過對3個(gè)有效成分的得率進(jìn)行綜合評價(jià)，選取70%乙醇作為提取溶劑。

2.2.3 料液比:取 5 份等量藥材，分別加入 6、8、10、12、14倍的70%的乙醇，各浸泡2h，提取1次，1h/次。將提取液過濾、濃縮和定容，得供試品液，按前述方法分別測定綠原酸、總黃酮和牛蒡子苷含量，計(jì)算有效成分得率。

一般來說，溶媒用量越大，越利于有效成分的提取，隨著料液比的增大，有效成分得率也在增加。從圖2可看出，當(dāng)料液比達(dá)到1:12后，綠原酸、牛蒡子苷得率隨料液比的變化不大，說明溶劑已將有效成分基本溶出完全;當(dāng)料液比為1:8時(shí)，最有利于總黃酮的提取。綜合各料液比對有效成分得率的影響，從節(jié)約角度出發(fā)，選取料液比為1:10來進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

圖1 乙醇濃度對提取的影響

圖2 藥材與溶劑比對提取的影響

2.2.4 提取時(shí)間:取6份等量的藥材，分別用10倍量70%乙醇浸泡 2h，提取 1 次，分別提取 0.5、1、1.5、2、2.5、3(h)。將提取液過濾、濃縮和定容，得供試品液，分別測定綠原酸、總黃酮和牛蒡子苷含量，計(jì)算有效成分得率。結(jié)果見圖3。

提取時(shí)間過短不利于有效成分的浸出，但時(shí)間過長又會(huì)使大量雜質(zhì)成分溶出，且有效成分的活性受到破壞，得不償失，因此要控制好提取時(shí)間。由圖3可以看出，隨著提取時(shí)間的延長，有效成分得率提高。但時(shí)間增長到1.5h總黃酮和牛蒡子苷得率達(dá)到最大值，繼續(xù)延長提取時(shí)間后，總黃酮和牛蒡子苷得率反而降低，說明提取時(shí)間過長會(huì)破壞有效成分，因此提取時(shí)間控制在1.5h左右即可。

圖3 提取時(shí)間對提取率的影響

圖4 浸泡時(shí)間對提取率的影響

2.2.5 提取次數(shù):取3份等量藥材，各用10倍量70%的乙醇浸泡2h，分別提取1次、2次、3次，1h/次。將提取液過濾、濃縮、定容，得供試品液，測定綠原酸、總黃酮和牛蒡子苷含量，計(jì)算有效成分得率。結(jié)果見表2。

表2 提取次數(shù)對提取效果的影響(n=3)

由表2可見，有效成分的得率隨著提取次數(shù)的增加而增加。多次提取較一次提取可提高有效成分的浸出率，但不適當(dāng)?shù)卦黾犹崛〈螖?shù)會(huì)增加生產(chǎn)能耗，造成浪費(fèi)，一般提取次數(shù)不超過3次為宜。

2.2.6 浸泡時(shí)間:取4份等量藥材，分別用10倍量70%的乙醇浸泡 0、1、2、2、3(h)，各提取 1 次，1h/次。將提取液過濾、濃縮和定容，得供試品液，分別測定綠原酸、總黃酮和牛蒡子苷含量，計(jì)算有效成分得率。

中藥飲片多數(shù)是干燥狀態(tài)，在正式提取前予以適當(dāng)?shù)慕?，能使飲片吸收溶媒，使組織浸潤膨脹，有利于提取過程中溶質(zhì)的加速溶解和擴(kuò)散。提取時(shí)大多數(shù)情況下溫度較高，如果中藥材原料直接與熱溶媒接觸，會(huì)使表面的蛋白質(zhì)層受熱凝固，妨礙后續(xù)溶劑對細(xì)胞組織的滲透浸潤，因此先用溶媒浸泡待提取原料后再進(jìn)行提取，能夠避免這一弊端。

從圖4可看出，浸泡后有效成分的得率明顯高于不浸泡而直接提取時(shí)有效成分的得率，浸泡時(shí)間達(dá)2h，綠原酸和牛蒡子苷浸出效果較好，綜合3個(gè)有效成分得率大小，選擇在提取前先浸泡2h。

3 結(jié)論

本文選取了溶媒、醇濃度、料液比、提取時(shí)間、提取次數(shù)和浸泡時(shí)間等6個(gè)單因素考察了清喉顆粒的提取工藝。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:乙醇對有效成分的提取效果優(yōu)于水的效果;70%的乙醇更適于有效成分的提取;從節(jié)約原料的角度出發(fā)，綜合料液比對3種有效成分的影響大小，確定了料液比為1:10;由于長時(shí)間的煎煮會(huì)對造成有效成分的損失，選擇提取時(shí)間為1.5h;浸泡2h再進(jìn)行復(fù)方的提取效果更佳。

［1］周志錦.金銀花及其制劑中綠原酸的含量測定［J］.浙江中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2002，26(4):82

［2］杜守穎，吳青.薄層掃描法測定小兒外感貼膏劑中綠原酸的含量［J］.時(shí)珍國藥研究，1997，8(2):131

［3］陳鋼，侯世祥，等.金銀花提取物中綠原酸的穩(wěn)定性研究［J］.中國中藥雜志，2003，28(3):223 ～225

［4］韋建榮，等.感冒舒中綠原酸的HPLC測定［J］.藥物分析雜志，1995.30(增刊):288 ～289.

［5］增祥林.正交設(shè)計(jì)研究銀黃制劑提取物的制備工藝［J］.數(shù)理醫(yī)藥學(xué)雜志，2001，14(1):56 ～58

［6］李靜，高衛(wèi)華，等.金銀花煎煮工藝研究［J］.北京中醫(yī)藥大學(xué)雜志，1994，17(5):55 ～56

［7］王小琳，張玉杰，石任兵.正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)選牛蒡子的提取工藝［J］.北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2003，26(4):64 ～65

［8］徐海波.高效液相色譜法測定牛蒡子配方顆粒中牛蒡苷的含量［J］.時(shí)珍國醫(yī)國藥，2003，14(6):336～337

［9］孫文基，沙振方，袁勇.牛蒡子中牛蒡甙及其甙元薄層掃描內(nèi)標(biāo)法測定［J］.藥物分析雜志，1993，13(3):178～180

［10］胡愛萍，陳朝暉，田薇.五味沙棘膠囊質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究［J］.中藥材，2000，23(10):647 ～648

［11］王尚義，鄭玉霞，劉聲普.水浸提沙棘葉總黃酮的工藝研究［J］.沙棘，2001，14(2):27～29