邱 梅，郝智慧，沈 巍，蔣皓靜，馬豐英

(1.青島康地恩藥業(yè)股份有限公司，山東青島 266061;2.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)化學(xué)與藥學(xué)院，山東青島 266111)

卡洛芬是美國(guó)輝瑞公司于20世紀(jì)70年代開(kāi)發(fā)的高效動(dòng)物用抗炎藥，由于其抗炎效果好，副作用小，在美國(guó)、加拿大和歐洲多個(gè)國(guó)家已獲得廣泛應(yīng)用。美國(guó)食品藥物管理局(FDA)獸藥中心(CVM)已批準(zhǔn)用于犬的高效COX－2選擇性抗炎藥。本實(shí)驗(yàn)室研制的新一代非甾體抗炎鎮(zhèn)痛藥物——卡洛芬注射液(商品名:痛立止)，其有效成分為卡洛芬，主要用于治療犬貓的風(fēng)濕、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，以及由炎癥引起的疼痛和其他原因引起的疼痛等。分別采用不同有機(jī)溶劑研制了兩種卡洛芬注射液，其中卡洛芬注射液I采用甲醛縮甘油和1，2－丙二醇作為有機(jī)溶劑，卡洛芬注射液II則選用二甲基乙酰胺和1，2－丙二醇作為有機(jī)溶劑，為了驗(yàn)證不同處方研制的卡洛芬注射液的抗炎、鎮(zhèn)痛效果及對(duì)皮膚刺激性，進(jìn)行了以下研究。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)藥物 受試藥物:卡洛芬注射液I(含量5%，批號(hào)20110926)、卡洛芬注射液II(含量5%，批號(hào)20110926)，均由青島康地恩藥業(yè)股份有限公司提供;對(duì)照藥物:托芬那酸注射液(含量4%，批號(hào)9A2164Q)，法國(guó)威隆公司產(chǎn)品。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 生理鹽水(0.9%，批號(hào)10050876，山東長(zhǎng)富潔晶藥業(yè)有限公司)、冰醋酸(批號(hào)091015，天津市富宇精細(xì)化工有限公司)、二甲苯(批號(hào)20090930，萊陽(yáng)市康德化工有限公司)、甲醛(批號(hào)20100512，萊陽(yáng)市康德化工有限公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)小鼠，體重18～22 g，青島市藥品檢驗(yàn)所提供;Wister大鼠，體重180～220 g，青島市藥品檢驗(yàn)所提供;新西蘭兔，青島寶依特實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 抗炎作用

1.4.1.1 對(duì)二甲苯致小鼠耳部炎癥的影響 小鼠40只，體重18～22 g，雌雄各半，預(yù)飼7 d后，隨機(jī)分為4組，具體分組見(jiàn)表1。每天一次，連續(xù)給藥5 d，末次給藥后0.5 h，將致炎劑二甲苯 0.1 mL 均勻涂于小鼠左耳兩面，右耳作為對(duì)照，致炎15 min后將小鼠脫頸椎處死，沿耳廓線剪下兩耳，用直徑8 mm打孔器分別在兩耳的同一部位打下左右耳片，隨即用電子天平稱(chēng)重，以?xún)啥亓恐钭鳛檠仔阅[脹度，并計(jì)算腫脹抑制率，用腫脹抑制率表示藥物抗炎強(qiáng)度。

1.4.1.2 對(duì)甲醛所致大鼠足趾腫脹的影響 取Wister大鼠24只，雌雄各半，隨機(jī)分成4組，每組6只。具體分組情況見(jiàn)表1。每只大鼠每天給藥1次，連續(xù)給藥5 d，于末次給藥0.5 h后，右后足趾部皮下注射2.5%的甲醛溶液0.05 mL。分別于致炎前及致炎后0.5、1、2、4 h 測(cè)量足趾厚度，以致炎前后足趾厚度之差作為炎性腫脹度，并計(jì)算腫脹抑制率。結(jié)果用F檢驗(yàn)進(jìn)行分析。腫脹抑制率(%)=(空白對(duì)照組平均腫脹度－藥物組平均腫脹度)/空白對(duì)照組平均腫脹度×100%。

1.4.2 鎮(zhèn)痛作用

1.4.2.1 對(duì)小鼠熱板實(shí)驗(yàn)的影響［1－2］將小鼠放于調(diào)節(jié)到(55±0.5)℃熱板上(置于玻璃杯內(nèi)，注意不要將燒杯拿出水浴鍋，以保持其杯底溫度一致)，記錄其從接觸熱板到開(kāi)始舔足的時(shí)間(s)作為給藥前的痛閾值，剔除不舔足及給藥前痛閾值大于30 s或者小于5 s的小鼠，觀察截至?xí)r間為60 s。經(jīng)篩選選出合格的40只小鼠(雌雄各半)，按體重隨機(jī)分為4組，具體見(jiàn)表1，用于正式試驗(yàn)。

測(cè)量各組小鼠給藥前的痛閾值，每只小鼠測(cè)2次，兩次測(cè)痛間隔為5 min，取其平均值作為該動(dòng)物的基礎(chǔ)痛閾值。將受試小鼠按上述分組分別進(jìn)行皮下注射給藥。測(cè)量小鼠給藥后0.25、0.5、1 h的熱板反應(yīng)時(shí)間。記錄每組各時(shí)間點(diǎn)的痛閾值，采用t檢驗(yàn)對(duì)各時(shí)間的結(jié)果進(jìn)行數(shù)理統(tǒng)計(jì)。

1.4.2.2 對(duì)冰醋酸致小鼠扭體實(shí)驗(yàn)的影響［3－4］取40只小鼠(雌雄各半)，按體重隨機(jī)分為4組，具體見(jiàn)表1。各組小鼠給藥后0.25 h，每只腹腔注射0.7%的冰醋酸(10 mL/kg 體重，約0.2 mL/只)，以小鼠腹部?jī)?nèi)凹，伸展后肢，臀部抬高為準(zhǔn)，記錄各組小鼠第一次出現(xiàn)扭體反應(yīng)的時(shí)間和15 min內(nèi)發(fā)生扭體反應(yīng)的次數(shù)。對(duì)各組間的試驗(yàn)結(jié)果采用t檢驗(yàn)進(jìn)行數(shù)理統(tǒng)計(jì)。扭體反應(yīng)抑制率(%)=(空白組平均扭體次數(shù)一給藥組平均扭體次數(shù))÷空白組平均扭體次數(shù)×100%。

表1 試驗(yàn)分組及給藥情況

1.4.3 對(duì)兔的皮膚刺激試驗(yàn) 20只兔子，于給藥前24 h將背部?jī)蓚?cè)去毛，試驗(yàn)采用左右自身對(duì)比，一側(cè)為生理鹽水對(duì)照，另一側(cè)為試驗(yàn)藥物，具體分組見(jiàn)表2。給受試藥物后，觀察兔是否尖叫等疼痛反應(yīng)及注射部位有無(wú)紅腫、水腫等，或按壓注射部位觀察其有無(wú)不良反應(yīng)。若有疼痛反應(yīng)，則對(duì)受試藥物分步試驗(yàn):即將其主要有效成分及輔助成分分開(kāi)注射給藥，觀察其刺激性。皮膚刺激性反應(yīng)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)表3及結(jié)果評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)表4。

表2 試驗(yàn)分組及給藥情況

表3 皮膚刺激性反應(yīng)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

表4 結(jié)果評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

1.5 數(shù)據(jù)分析 采用SPSS11.5軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，檢驗(yàn)其差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗炎作用

2.1.1 對(duì)二甲苯致小鼠耳部炎癥的影響 結(jié)果如表5所示。表5結(jié)果顯示，各給藥組均能降低小鼠致炎耳部的腫脹度，且與生理鹽水組差異顯著(P＜0.05)，其中托芬那酸組的腫脹抑制率最高，為42.9%，其次為卡洛芬注射液I組。

表5 受試藥物對(duì)二甲苯致小鼠耳部炎癥的影響( ± s)

表5 受試藥物對(duì)二甲苯致小鼠耳部炎癥的影響( ± s)

注:*為與生理鹽水組差異顯著(P＜0.05)。

組別 劑量/(mL·kg－1)腫脹度/mm腫脹抑制率/%生理鹽水組0.7 23.3 ±4.0 －卡洛芬注射液 I組 0.7 15.4 ±2.1* 33.9卡洛芬注射液 II組 0.7 17.9 ±1.5* 23.2托芬那酸注射液組 0.7 13.3 ±2.2*42.9

2.1.2 對(duì)甲醛所致大鼠足趾腫脹的影響 結(jié)果如表6所示。由表6可見(jiàn)，大鼠足趾致炎后0.5～4 h各給藥組的腫脹度均低于生理鹽水組，差異顯著(P＜0.05);卡洛芬注射液II組在致炎后1～4 h的腫脹度較其他兩組高，且與托芬那酸組差異顯著(P＜0.05)。托芬那酸組和卡洛芬注射液I組的腫脹抑制率均在33.3%以上，好于卡洛芬注射液II組。

表6 受試藥物對(duì)甲醛所致大鼠足趾腫脹的影響( ± s)

表6 受試藥物對(duì)甲醛所致大鼠足趾腫脹的影響( ± s)

注:*為與生理鹽水組差異顯著(P＜0.05);a為與托芬那酸組差異顯著(P＜0.05)。

組別 劑量/(mL·kg－1)致炎后不同時(shí)間足腫脹度(mm)/抑制率(%)0.5 h 1 h 2 h 4 h生理鹽水組0.3 7.9 ±1.0 13.2 ±1.8 18.2 ±0.8 15.3 ±0.9卡洛芬注射液 I組 0.3 4.8 ±1.6* 8.5 ±1.1* 11.5 ±1.7* 10.2 ±0.7*39.2 35.6 36.8 33.3卡洛芬注射液 II組 0.3 5.5 ±1.3* 9.7 ±1.0*a 13.9 ±2.0*a 11.5 ±1.6*a 30.4 26.5 23.6 24.8托芬那酸注射液組 0.3 4.9 ±0.7* 7.3 ±0.8* 9.3 ±1.0* 8.4 ±0.9*37.9 44.7 48.9 45.1

2.2 鎮(zhèn)痛作用

2.2.1 對(duì)小鼠熱板實(shí)驗(yàn) 結(jié)果如表7所示。表7結(jié)果顯示，卡洛芬注射液I組和托芬那酸組在15、30 min時(shí)均可有效延長(zhǎng)小鼠熱板痛閾值;卡洛芬注射液II組沒(méi)有明顯鎮(zhèn)痛效果。各組間痛閾值差異不顯著(P ＞0.05)。

2.2.2 受試藥物對(duì)冰醋酸致小鼠扭體實(shí)驗(yàn) 結(jié)果如表8所示。由表8試驗(yàn)結(jié)果可知，卡洛芬注射液組對(duì)小鼠扭體的潛伏期沒(méi)有明顯改變，但扭體次數(shù)相對(duì)較少，扭體抑制率分別為34.7%和17.5%。托芬那酸組第一次扭體的潛伏期較長(zhǎng)，與生理鹽水組差異顯著(P＜0.05)，扭體抑制率為42.6%。

表7 受試藥物對(duì)小鼠熱板實(shí)驗(yàn)的影響( ± s)

表7 受試藥物對(duì)小鼠熱板實(shí)驗(yàn)的影響( ± s)

組別 劑量/(mL·kg－1) 基礎(chǔ)痛閾值/s 15 min痛閾值/s 30 min痛閾值/s 60 min痛閾值/s生理鹽水組0.7 13.1 ±4.8 12.2 ±1.1 13.2 ±2.5 14.4 ±3.0卡洛芬注射液 I組 0.7 11.9 ±3.5 16.7 ±2.8 13.6 ±0.5 11.4 ±1.6卡洛芬注射液 II組 0.7 14.9 ±6.2 14.8 ±5.3 10.0 ±2.8 10.3 ±1.9托芬那酸注射液組0.7 13.2 ±1.3 14.6 ±5.8 16.4 ±2.9 13.1 ±1.3

表8 受試藥物對(duì)小鼠扭體實(shí)驗(yàn)的影響( ± s)

表8 受試藥物對(duì)小鼠扭體實(shí)驗(yàn)的影響( ± s)

注:*為與托芬那酸組差異顯著(P＜0.05)。

組別 劑量/(mL·kg－1)潛伏期/min 15 min內(nèi)扭體次數(shù)扭體抑制率/%生理鹽水組 0.7 3.9 ±0.1 32.0 ±6.4*－卡洛芬注射液 I組 0.7 3.5 ±0.7*20.9 ±8.6 34.7卡洛芬注射液 II組 0.7 3.7 ±2.922.7 ±5.8 17.5托芬那酸注射液組0.7 8.7 ±3.7 12.0 ±8.1 42.6

2.3 受試藥物對(duì)兔皮膚刺激觀察結(jié)果 兔子皮膚注射給藥后，各給藥組均未出現(xiàn)尖叫、皮膚紅腫等不良反應(yīng)，按壓其注射部位亦無(wú)不良反應(yīng)。

3 討論與結(jié)論

近年來(lái)，由于犬貓的生活習(xí)性及創(chuàng)傷引起的犬貓關(guān)節(jié)病越來(lái)越多。其中，犬的關(guān)節(jié)病主要有風(fēng)濕性、類(lèi)風(fēng)濕性、外傷性、骨性及化膿性關(guān)節(jié)炎，貓的關(guān)節(jié)病主要為急性敗血癥性關(guān)節(jié)炎和慢性關(guān)節(jié)炎。目前，針對(duì)風(fēng)濕性、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)病的治療以非甾體抗炎藥為首選藥物。獸用止痛藥主要有非甾體抗炎止痛藥、中樞性止痛藥、麻醉性止痛藥三大類(lèi)，止痛效果以嗎啡、杜冷丁等阿片類(lèi)藥最強(qiáng)，但其強(qiáng)大的鎮(zhèn)痛背后是嚴(yán)重的依賴(lài)性和成癮性，從而限制了其臨床的應(yīng)用。

卡洛芬是新一代非甾體抗炎鎮(zhèn)痛藥，具有強(qiáng)的抗炎、鎮(zhèn)痛、解熱作用，較阿司匹林、保泰松、對(duì)乙酰氨基酚、布洛芬強(qiáng)，還具有吸收快、副作用小的特點(diǎn)。

抗炎試驗(yàn)結(jié)果表明，各給藥組均能降低小鼠炎癥部位的腫脹度，且與生理鹽水組差異顯著(P＜0.05)，其中托芬那酸組的腫脹抑制率最高，其次為卡洛芬注射液I組。在對(duì)小鼠的熱板試驗(yàn)以及對(duì)冰醋酸致小鼠扭體試驗(yàn)中，卡洛芬注射液I較卡洛芬注射液II有更好的抑制效果，說(shuō)明選擇甲醛縮甘油和1，2－丙二醇作為有機(jī)溶劑較選擇二甲基乙酰胺和1，2－丙二醇效果好。研究發(fā)現(xiàn)配方藥卡洛芬注射液I在短時(shí)間內(nèi)對(duì)小鼠的鎮(zhèn)痛效果較對(duì)照組托芬那酸強(qiáng)，但維持時(shí)間較托芬那酸短，表明本配方藥效快，可以用于緩解動(dòng)物急性疼痛性疾病。皮膚刺激試驗(yàn)結(jié)果表明本品的刺激性很小，無(wú)不良反應(yīng)。

綜上所述，研究所選用的配方藥卡洛芬注射液I的抗炎、鎮(zhèn)痛效果顯著，安全無(wú)刺激性，具有廣闊的應(yīng)用前景。

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