顏妍 楊琪 潘濤 馬路 汪建國(guó) 周柱亮 劉暢

(北京軍區(qū)北戴河療養(yǎng)院全軍腎臟病中西醫(yī)結(jié)合治療中心，066100)

腎小球臟層上皮細(xì)胞(足細(xì)胞)是腎小球固有細(xì)胞之一，參與腎小球?yàn)V過(guò)膜屏障的形成，同時(shí)也是終末分化細(xì)胞，一旦脫落后缺乏增殖再生能力，造成腎小球基底膜的不可逆性損傷[1]。在足細(xì)胞上存在多種特異性標(biāo)志物，如synaptopodin、WT-1、GLEPP-1、nephrin、podocalyxin及 C3b受體等[2]。其中synaptopodin是一種與肌動(dòng)蛋白微絲偶聯(lián)的蛋白，其富含脯氨酸，是一種線狀蛋白質(zhì)，分子量為73.7 kDa，在機(jī)體內(nèi)只表達(dá)于腎小球的足細(xì)胞和后腦的突觸內(nèi)。它的功能尚不清楚，初步研究認(rèn)為它在足突活動(dòng)中發(fā)揮重要作用。既往研究表明，在多種腎小球疾病進(jìn)展過(guò)程中均涉及到足細(xì)胞的異常變化，這點(diǎn)在糖尿病腎病的研究中也日益得到重視[3-4]。本研究在我們前期研究工作的基礎(chǔ)上[5]，采用間接免疫熒光雙標(biāo)記技術(shù)，觀察synaptopodin和WT-1在糖尿病腎病患者腎組織中的表達(dá)并探討其意義。

1 材料和方法

1.1 研究對(duì)象 選取2000-05—2010-05 10年間在我院經(jīng)腎活檢明確診斷為糖尿病腎病的2型糖尿病患者的腎活檢組織標(biāo)本，共35例，其中男24例，女11例，平均年齡(49.3±12.4)歲。腎穿刺活檢組織經(jīng)甲醛固定、石蠟包埋，2 μm厚度切片，行HE、PAS、PASM和Masson三色染色，根據(jù)組織病理改變特點(diǎn)分為彌漫性系膜硬化組(n=20)和結(jié)節(jié)性硬化組(n=15)。患者腎活檢時(shí)的年齡、病程、空腹血糖(FBG)、糖化血紅蛋白(HbA1c)、血肌酐(SCr)、24 h尿蛋白定量(TUPr)和評(píng)估的腎小球?yàn)V過(guò)率(eGFR)經(jīng)MDRD公式計(jì)算。正常對(duì)照組7例，選自因腎臟腫瘤而行切除的腎臟，所取腎組織標(biāo)本遠(yuǎn)離腫瘤部分。

1.2 腎組織內(nèi)synaptopodin和WT-1的表達(dá)檢測(cè)

1.2.1 間接免疫熒光雙標(biāo)記法 石蠟切片脫蠟，微波抗原修復(fù)(95℃，10 min)；10%小牛血清封閉，室溫，20 min；加小鼠抗人synaptopodin單克隆抗體(購(gòu)自美國(guó)Maine生物技術(shù)公司)，4 ℃，12 h，PBS洗片，5 min×3，加FITC標(biāo)記的兔抗小鼠IgG(購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)公司)，室溫，20 min，PBS洗片，5 min×3；加兔抗人WT-1多克隆抗體(購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司)，4 ℃，12 h，PBS洗片，5 min×3，加羅丹明標(biāo)記的羊抗兔IgG(購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)公司)，室溫，20 min，PBS洗片，5 min×3；封片。

1.2.2 激光共聚焦熒光顯微鏡觀察并進(jìn)行定量分析 激光共聚焦熒光顯微鏡為Bio-Rad型(美國(guó)，Bio-Rad公司)，采用雙通道掃描采集圖像，F(xiàn)ITC的激發(fā)光波長(zhǎng)為488 nm，羅丹明的激發(fā)光波長(zhǎng)為543 nm，通過(guò)雙熒光集成圖像觀察synaptopodin和WT-1陽(yáng)性染色的分布。用Imagerpro 5.0圖像分析軟件分別測(cè)量10個(gè)腎小球面積(μm2)及每個(gè)腎小球內(nèi)synaptopodin和WT-1陽(yáng)性面積(μm2)，計(jì)算每個(gè)腎小球synaptopodin和WT-1陽(yáng)性面積百分比，取其平均值作為二者的表達(dá)指標(biāo)[6]。

1.2.3 統(tǒng)計(jì)分析 數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用非配對(duì)t檢驗(yàn)；synaptopodin和WT-1陽(yáng)性表達(dá)與臨床指標(biāo)之間的相關(guān)性采用直線相關(guān)分析；統(tǒng)計(jì)軟件為SPSS 11.0，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組不同病理改變的糖尿病腎病患者的臨床病理特點(diǎn) 對(duì)兩組不同病理改變的糖尿病腎病患者的一般臨床情況及足細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果顯示，與彌漫性系膜硬化組患者相比，結(jié)節(jié)性硬化組患者eGFR降低，TUPr和SCr升高，足細(xì)胞計(jì)數(shù)減少(P＜0.05，表1)。

2.2 synaptopodin和WT-1間接免疫熒光雙標(biāo)記檢測(cè)結(jié)果正常對(duì)照組內(nèi)synaptopodin主要呈顆粒狀表達(dá)于腎小球的基底膜區(qū)域(綠色熒光)，而WT-1主要表達(dá)于腎小球的足細(xì)胞上(紅色熒光)。圖像分析結(jié)果統(tǒng)計(jì)分析顯示，與正常對(duì)照組相比，糖尿病腎病患者腎小球內(nèi)synaptopodin和WT-1的表達(dá)均降低，且結(jié)節(jié)硬化組較彌漫系膜硬化組降低更為顯著(P＜0.05，表2)。雙熒光集成圖像顯示synaptopodin和WT-1的表達(dá)變化一致。

表2 synaptopodin和WT-1免疫熒光圖像分析結(jié)果

3 討論

有研究表明，與足細(xì)胞及其裂孔膜相關(guān)的一些分子如synaptopodin、nephrin、podocin、WT-1等的基因突變，可導(dǎo)致某些先天性或家族性腎病綜合征或蛋白尿[7]，可見(jiàn)足細(xì)胞及其裂孔膜的完整是維系正常腎小球?yàn)V過(guò)屏障的關(guān)鍵。本研究結(jié)果也提示，synaptopodin和WT-1表達(dá)減少和消失同樣會(huì)導(dǎo)致足細(xì)胞及其裂孔膜的完整性受損，從而參與蛋白尿和腎小球節(jié)段硬化的形成。

研究顯示足細(xì)胞是腎小球?yàn)V過(guò)屏障中獨(dú)特的胰島素敏感細(xì)胞[8]，糖尿病發(fā)病過(guò)程中最根本的改變是胰島素對(duì)細(xì)胞敏感性降低。研究發(fā)現(xiàn)糖尿病腎病腎小球結(jié)構(gòu)變化的特征是腎小球基底膜增厚、系膜基質(zhì)積聚、進(jìn)而K-W結(jié)節(jié)形成，使毛細(xì)血管濾過(guò)面積減少，導(dǎo)致GFR降低，但這種結(jié)構(gòu)變化如何導(dǎo)致蛋白尿增多的機(jī)制尚未完全闡明。既往研究認(rèn)為糖尿病腎病蛋白尿發(fā)生的基礎(chǔ)首先是血流動(dòng)力學(xué)的改變，繼而腎臟局部一些細(xì)胞因子，如血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(VEGF)表達(dá)增多促進(jìn)了蛋白尿的形成[9-10]。本研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病腎病患者足細(xì)胞數(shù)及WT-1的表達(dá)均低于正常對(duì)照組，且結(jié)節(jié)性硬化組顯著低于彌漫系膜硬化組，由于足細(xì)胞在腎小球?yàn)V過(guò)屏障中的獨(dú)特作用，也表明在糖尿病腎病的形成和進(jìn)展過(guò)程中存在足細(xì)胞損傷。

synaptopodin和WT-1是足細(xì)胞分化成熟的標(biāo)志物，本研究發(fā)現(xiàn)，與正常對(duì)照組相比，糖尿病腎病患者腎小球內(nèi)synaptopodin的表達(dá)下調(diào)，結(jié)節(jié)硬化組顯著低于彌漫系膜硬化組，同時(shí)synaptopodin的表達(dá)與患者TUPr呈負(fù)相關(guān)，與eGFR呈正相關(guān)，提示synaptopodin表達(dá)異常同樣參與了糖尿病腎病的進(jìn)展過(guò)程。

synaptopodin表達(dá)減少一方面是足細(xì)胞數(shù)目減少所致，另一方面足細(xì)胞各種特異性標(biāo)志物之間構(gòu)成了足細(xì)胞特有的結(jié)構(gòu)框架，如果任何一種標(biāo)志物異常均可導(dǎo)致足細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的破壞，由此我們推測(cè)在糖尿病腎病形成的早期可能即存在synaptopodin異常，后者參與了足細(xì)胞的損傷過(guò)程。Blanco等[11]采用血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑類藥物對(duì)Zucker大鼠進(jìn)行治療，結(jié)果發(fā)現(xiàn)腎小球內(nèi)synaptopodin的表達(dá)上調(diào)，故腎素-血管緊張素系統(tǒng)活化是影響糖尿病腎病形成和進(jìn)展中synaptopodin表達(dá)減少的重要因素之一，但在此過(guò)程中是否還存在其他調(diào)控因素影響synaptopodin的表達(dá)尚需進(jìn)一步研究證實(shí)。

綜上所述，足細(xì)胞的異常對(duì)于腎小球疾病的發(fā)展及預(yù)后產(chǎn)生重要的影響，Synaptopodin等足細(xì)胞標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)為今后腎小球疾病的研究提供了新的切入點(diǎn)。synaptopodin表達(dá)減少可能參與了足細(xì)胞損傷，后者促進(jìn)了糖尿病腎病的形成和進(jìn)展。但在此過(guò)程中是否還存在其他調(diào)控因素影響synaptopodin的表達(dá)尚需進(jìn)一步研究證實(shí)。然而我們認(rèn)為針對(duì)足細(xì)胞分子標(biāo)志物的干預(yù)將可能成為延緩糖尿病腎病進(jìn)展的重要治療措施。

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