吳 鋒，林日陽，何立群

(上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院腎內(nèi)科、肝腎疾病病證教育部重點實驗室、上海市高校中醫(yī)內(nèi)科E-研究院，上海 200021)

中醫(yī)藏象理論認(rèn)為“腎藏精，主骨生髓”。目前臨床上多用補(bǔ)腎中藥治療骨質(zhì)疏松等骨代謝疾病，補(bǔ)腎中藥可通過多環(huán)節(jié)、多途徑調(diào)節(jié)骨形成與骨吸收［1］。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)從腎臟對鈣磷及激素內(nèi)分泌的角度來闡釋中醫(yī)的腎主骨理論。腎主骨理論的實驗研究動物模型，是用人為方法復(fù)制腎損傷或骨損傷的動物模型，然后從組織學(xué)、病理學(xué)、形態(tài)計量學(xué)、生物力學(xué)、分子生物學(xué)等角度觀察骨或腎的變化，以此來尋找腎損及骨和骨損及腎的客觀依據(jù)［2］?！澳I主骨”的理論體系研究中還缺少應(yīng)用體外直接客觀的實驗方法。腎小球系膜細(xì)胞是腎小球的主要固有細(xì)胞之一，成骨細(xì)胞是骨的主要功能細(xì)胞，我們根據(jù)中醫(yī)“腎主骨”的理論，應(yīng)用體外細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，避免體內(nèi)復(fù)雜的影響因素，首次將腎臟的主要功能細(xì)胞-腎小球系膜細(xì)胞直接作用于骨的主要功能細(xì)胞-成骨細(xì)胞，在細(xì)胞水平觀察兩者的內(nèi)在聯(lián)系，為進(jìn)一步研究和證實中醫(yī)“腎主骨”理論提供更直接及客觀確切的現(xiàn)代科學(xué)實驗基礎(chǔ)，為中醫(yī)理論的客觀化研究和臨床研發(fā)補(bǔ)腎中藥防治骨及骨關(guān)節(jié)疾病提供新的實驗方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 新生(出生24 h以內(nèi))紅皮 SD大鼠和100g SD雄性大鼠，由上海中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供。

1.1.2 主要實驗試劑 RPMI-1640基礎(chǔ)培養(yǎng)液(GIBCO)、堿性磷酸酶(ALP)及骨橋蛋白(OPN)檢測試劑(Biotnt公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞提取分離 (1)腎小球系膜細(xì)胞提取分離:在無菌條件下分離SD雄性大鼠腎臟，采用系列篩網(wǎng)法分離腎小球，取上清液經(jīng)0.1%IV型膠原酶消化后，加入RPMI-1640基礎(chǔ)培養(yǎng)液制成懸液，使腎小球懸液均勻種植在瓶底。將培養(yǎng)瓶置入37℃5%CO2的孵箱中培養(yǎng)。3周后傳代，選擇第3～5代系膜細(xì)胞用于實驗。采用免疫熒光法進(jìn)行鑒定，抗結(jié)蛋白抗體陽性、抗細(xì)胞角蛋白抗體陰性證實為系膜細(xì)胞;(2)成骨細(xì)胞提取分離:取新生SD大鼠顱蓋骨剪碎，經(jīng)胰蛋白酶、Ⅱ型膠原酶振蕩，收集上清液離心，吸棄上清液。加入RPMI-1640基礎(chǔ)培養(yǎng)液，制成細(xì)胞懸液，采用反復(fù)貼壁法純化，接種于25cm2培養(yǎng)瓶中，置入5%CO237℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)。細(xì)胞匯合達(dá)80%左右培養(yǎng)瓶底，即進(jìn)行傳代。本實驗均采用3～5代細(xì)胞。細(xì)胞鑒定:顯微鏡下見細(xì)胞貼壁生長呈三角形、紡錘形和多角形等多種形態(tài)，行堿性磷酸酶染色，倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞的細(xì)胞核及細(xì)胞質(zhì)上形成的灰黑至深黑色顆粒狀或片狀沉淀。

1.2.2 成骨細(xì)胞的分組培養(yǎng) 取成骨細(xì)胞以5×104個/ml，100ul/孔接種于96孔培養(yǎng)板內(nèi)，細(xì)胞貼壁后更換含0.5%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)液培養(yǎng)12 h，然后分成正常血清組和系膜細(xì)胞組2組，給予2種不同培養(yǎng)液，每組8孔，隔天換液1次。

1.2.3 培養(yǎng)液的制備 (1)正常血清組培養(yǎng)液:SD雄性大鼠用3%戊巴比妥腹腔注射麻醉后，腹主動脈取血、離心(3000r/min，20 min)并收集上清液，－20℃冷藏，使用前4℃冰箱解凍過夜，56℃水浴滅活20min過濾除菌，用RPMI-1640培養(yǎng)液稀釋至10%;(2)系膜細(xì)胞組培養(yǎng)液:取系膜細(xì)胞均勻接種于25cm2培養(yǎng)瓶中，至細(xì)胞鋪占瓶底約80%。換用含10%的正常小鼠血清RPMI-1640培養(yǎng)液，10ml/瓶，繼續(xù)培養(yǎng)，3d后吸取上清液備用。使用時用正常血清組培養(yǎng)液稀釋至20%。

1.2.4 成骨細(xì)胞增殖檢測(MTT法)各組分別在培養(yǎng) 24h、48h、72h、120h 后，加入 20μl新鮮配制過濾除菌的MTT(5mg/ml)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后棄去培養(yǎng)液，倒置 96孔板于吸水紙上，加入 100μl DMSO，振蕩孵育 10min，在酶標(biāo)儀上檢測光密度(OD)值，檢測波長490 nm，每組8孔。

1.2.5 成骨細(xì)胞上清液ALP及OPN濃度的檢測 各組在培養(yǎng)72h后吸取培養(yǎng)液，ELISA法檢測ALP及OPN濃度，步驟嚴(yán)格按照說明書，每組5孔。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 成骨細(xì)胞增殖的情況

表1顯示，系膜細(xì)胞組和正常血清組的成骨細(xì)胞都隨著時間而逐步增殖。在正常血清組，后3個時間點與培養(yǎng) 24h相比，分別增長了 40.7%、66.8%、322.8%。在系膜細(xì)胞組后3個時間點與培養(yǎng) 24h 相比，分別增長了 24.1% 、54.7% 、176.1% 。但系膜細(xì)胞組在各時間點的增殖要明顯快于正常血清組(P＜0.05)，系膜細(xì)胞組比正常血清組各時間點分別高 72.4% 、52.1% 、60.0% 、12.6% ，說明腎系膜細(xì)胞培養(yǎng)上清液能作用于成骨細(xì)胞，促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖。

表1 成骨細(xì)胞增殖的OD值(n=8，±s)

表1 成骨細(xì)胞增殖的OD值(n=8，±s)

注:與正常血清組比較:*P＜0.05

24h 48h 72h 120h正常血清組 0.337 ±0.038 0.474 ±0.067 0.562 ±0.053 1.425 ±組 別0.151系膜細(xì)胞組 0.581 ±0.064* 0.721 ±0.202* 0.899 ±0.149* 1.604 ±0.040*

2.2 成骨細(xì)胞上清液ALP及OPN濃度的情況

表2顯示，在第3天系膜細(xì)胞組的ALP濃度高于正常血清組30.5%，要明顯高于正常血清組(P＜0.05)。系膜細(xì)胞組的 OPN濃度高于正常血清組55.0%，說明腎系膜細(xì)胞培養(yǎng)上清液能作用于成骨細(xì)胞，促進(jìn)成骨細(xì)胞分泌ALP及OPN。

表2 第3天成骨細(xì)胞上清液ALP及OPN的濃度(n=5，±s)

表2 第3天成骨細(xì)胞上清液ALP及OPN的濃度(n=5，±s)

注:與正常血清組比較:*P＜0.05

組 別 ALP(μg/L)OPN(μg/L)正常血清組13.72 ±10.16 2.840 ±0.476 8.85 ± 8.85系膜細(xì)胞組 3.707 ±0.294*

圖1 各時間點成骨細(xì)胞增殖情況

3 討論

《醫(yī)經(jīng)精義》中記載:“腎藏精，精生髓，髓生骨，故骨者，腎之所合也。髓者，腎精所生，精足則髓足，髓在骨內(nèi)，髓足者骨強(qiáng)?！薄端貑枴つ嬲{(diào)論》曰:“腎者水也，而生于骨，腎不生，則髓不能滿，故寒甚至骨也，所以不能凍栗者……病名曰骨痹，是人當(dāng)攣節(jié)也?！敝嗅t(yī)從生理及病理上都對“腎”與“骨”的密切聯(lián)系作了詳盡闡述。在治療學(xué)上，《圣濟(jì)總錄·諸痹門》中強(qiáng)調(diào)以補(bǔ)腎填精為君藥治療骨痹。對中醫(yī)“腎主骨”理論可以從兩個方面理解:一是解剖學(xué)意義上的腎臟對骨代謝的影響，其實質(zhì)主要指腎臟1-α羥化酶的活性及腎臟對鈣磷代謝的調(diào)控;二是中醫(yī)學(xué)綜合意義上的腎對骨代謝的復(fù)雜調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，既包括對下丘腦-垂體-靶腺軸不同環(huán)節(jié)、不同層面功能的概括，也包括骨骼組織局部微環(huán)境各種調(diào)節(jié)因子的功能［3］。

中醫(yī)“腎主骨”理論中的“腎”雖與現(xiàn)代解剖學(xué)上的腎臟并不完全等同，但腎臟是“腎主骨”理論體系中最主要的器官。腎臟與骨皆發(fā)生于胚胎外胚層，是同源器官，在發(fā)生學(xué)上有著相關(guān)性。目前對“腎主骨”的現(xiàn)代科學(xué)研究中，腎臟對骨代謝的影響主要是從腎臟對1-α羥化酶的活性及對鈣磷代謝的調(diào)控方面。近年來的研究表明，Wnt/β-Catenin-BMP信號途徑在調(diào)節(jié)腎臟發(fā)育、功能活動和骨代謝中具有重要的作用［4、5］。但目前的現(xiàn)代科學(xué)研究方法都未將腎臟與骨直接相聯(lián)系。

腎小球系膜細(xì)胞是腎小球的主要固有細(xì)胞之一，具有分泌多種生物活性物質(zhì)的功能。成骨細(xì)胞來源于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，是骨形成過程中的重要功能細(xì)胞，其主要功能是分泌骨基質(zhì)，不僅與骨的形成密切相關(guān)，而且在骨吸收過程中也起關(guān)鍵性作用。成骨細(xì)胞對骨組織的生長發(fā)育、骨代謝平衡、骨量維持和損傷修復(fù)起關(guān)鍵作用。本實驗首次應(yīng)用體外細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，排除了體內(nèi)多種因素的相互影響，將腎小球系膜細(xì)胞直接作用于成骨細(xì)胞，在細(xì)胞水平直接觀察兩者的內(nèi)在聯(lián)系，為“腎主骨”提供更直接及客觀的現(xiàn)代科學(xué)實驗方法。

實驗結(jié)果表明，腎系膜細(xì)胞能直接促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖及功能。系膜細(xì)胞組在各時間點要比正常血清組的成骨細(xì)胞增殖程度都明顯增加。ALP是成骨細(xì)胞所分泌的一種酶蛋白，與成骨細(xì)胞的分化有密切關(guān)系，是成骨細(xì)胞早期分化的標(biāo)志物，其活性的明顯升高是成骨細(xì)胞成熟的一大特征，也是評價機(jī)體成骨活性的特異性指標(biāo)［6］。我們參照文獻(xiàn)［7］，在成骨細(xì)胞培養(yǎng)第3天時檢測ALP濃度。結(jié)果表明，在第3天時系膜細(xì)胞組上清液的ALP濃度比正常血清組明顯增高。OPN是一種硫基化和磷酸化的糖蛋白，是骨組織中的主要非膠原蛋白。OPN在成骨細(xì)胞中廣泛存在，不同成熟階段的成骨細(xì)胞均能合成和分泌OPN，是成骨細(xì)胞的表型之一。結(jié)果表明，在第3天時系膜細(xì)胞組上清液的OPN濃度比正常血清組增高55.0%，說明腎小球的主要固有細(xì)胞可以直接促進(jìn)骨形成，調(diào)節(jié)骨代謝。通過檢測腎小球系膜細(xì)胞分泌的上清液對成骨細(xì)胞增殖及功能的影響，為進(jìn)一步研究中醫(yī)“腎主骨”理論現(xiàn)代科學(xué)基礎(chǔ)提供新思路、新途徑。

［1］王擁軍，卞 琴，崔學(xué)軍，等.“腎主骨”理論研究的思路與方法［J］.上海中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2010，24(1):8-12.

［2］王善金.腎主骨理論的現(xiàn)代研究概況［J］.光明中醫(yī)，2006，21(2):54-55.

［3］孔月晴.腎主骨、腎與骨代謝內(nèi)涵探討［J］.光明中醫(yī)，2010，25(3):353-354.

［4］Lyons JP，Miller RK，Zhou X，et al.Requirement of Wnt/beta-Catenin signaling in pronephric kidney development［J］.Mech Dev，2009，126(34):142-159.

［5］Kazama I，Mahoney Z，Miner JH，et al.Podocyte-derived BMP7 is critical for nephron development［J］.J Am Soc Nephrol，2008，19(11):2181-2191.

［6］李玉彬，謝利民，李 敏，等.健脾補(bǔ)腎方含藥血清對體外培養(yǎng)的兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞定向分化的影響［J］.中國中醫(yī)骨傷科雜志，2010，18(5):13-15.

［7］沈祥春，楊如會，彭 佼，等.健骨固本膠囊含藥血清對大鼠成骨細(xì)胞作用的實驗研究［J］.中華中醫(yī)藥雜志，2010，25(2):278-281.