張段玲，張彥龍，白素英

(東北林業(yè)大學(xué)，哈爾濱 150040)

小鼠抗食蟹猴IgG單克隆抗體的制備

張段玲，張彥龍，白素英

(東北林業(yè)大學(xué)，哈爾濱 150040)

目的 制備抗食蟹猴、恒河猴等非人靈長類實(shí)驗(yàn)動(dòng)物免疫球蛋白二級(jí)抗體，開展對其傳染病血清學(xué)快速診斷方法的建立。方法 采用飽和硫酸銨鹽析、Agarose-Protein G親和層析技術(shù)，從食蟹猴血清中提純 IgG。經(jīng)SDS-PAGE電泳鑒定，采用常規(guī)法免疫C57BL/6小鼠，三次免疫后取脾細(xì)胞與 Sp2/0-Ag14骨髓瘤細(xì)胞通過PEG4000融合制備雜交瘤細(xì)胞，利用間接ELISA、Western blot等方法進(jìn)行篩選、鑒定。結(jié)果 得到5株陽性雜交瘤，分別命名為2B6、2B7、2D9、3B2、5E4，并且5株雜交瘤分泌的抗體均與恒河猴的 IgG或血清發(fā)生交叉反應(yīng)，而與其他物種如東北虎、犬等動(dòng)物的IgG或血清無交叉反應(yīng)。結(jié)論 5株雜交瘤產(chǎn)生的單克隆抗體(McAb)具有較好免疫活性，且能長期、穩(wěn)定地分泌抗體。此項(xiàng)研究工作為后續(xù)研究食蟹猴、恒河猴傳染病血清學(xué)診斷方法奠定基礎(chǔ)。

食蟹猴;IgG;單克隆抗體;親和層析

食蟹猴(Macaca fascicularis)屬于靈長目(primates)猴科(Cercopithecidae)獼猴屬?，F(xiàn)階段我國養(yǎng)殖的實(shí)驗(yàn)猴主要是獼猴屬的食蟹猴和恒河猴，其中食蟹猴為外來種，兩者均被列入《瀕危野生動(dòng)植物種國際貿(mào)易公約(CITES)》附錄Ⅱ中［1］。獼猴屬動(dòng)物親緣關(guān)系上和人類比較接近，與人類遺傳物質(zhì)有75%～98.5%的同源性，是研究人類疾病的理想動(dòng)物模型，被廣泛的應(yīng)用于傳染病、遺傳性疾病、心血管疾病、內(nèi)分泌疾病、藥理學(xué)和毒理學(xué)等研究領(lǐng)域［2－4］。但是食蟹猴及其他非人類靈長類患病種類繁多，如 B病毒、猴痘、猴結(jié)核、猴副流感、麻疹病毒病、肝炎病毒病等［5－8］。因此需要建立相應(yīng)的診斷方法，以便對所用實(shí)驗(yàn)猴進(jìn)行徹底的檢查，排除疾病個(gè)體。目前我國雖然已建立一些診斷方法，但仍沒有一個(gè)完善的方法滿足實(shí)驗(yàn)猴疾病的排查和篩選，血清學(xué)方法是診斷疾病的有效手段之一，制備抗免疫球蛋白二級(jí)抗體是開展血清學(xué)診斷研究工作的前提。

本文針對食蟹猴IgG制備其單克隆抗體，并鑒定此抗體與恒河猴免疫球蛋白抗原相關(guān)性，為以后開展非人靈長類動(dòng)物疾病血清學(xué)診斷方法及診斷試劑盒的研制奠定了基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 食蟹猴血清、細(xì)胞及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

食蟹猴血清由東北林業(yè)大學(xué)野生動(dòng)植物檢測中心白素英老師惠贈(zèng)［SCXK(瓊)2004-0001］。SP2/0骨髓瘤細(xì)胞，本實(shí)驗(yàn)室保存。C57BL/6小鼠，購自哈爾濱醫(yī)科大學(xué)腫瘤防治研究所［SCXK(黑)2005-2007］。

1.2 試劑

鑒定 McAb 的亞型診斷試劑盒為SBA ClonotypingTMSystem/HRP，SouthernBiotech，Cat．No．5300-05;RPMI-1640 培 養(yǎng) 基，GIBCO，Cat．No．3180022;HATMediaSupplement(50×)Hybri-MaxTM，Sigma，Cat．No．H0262;HT Media Supplement(50 × )Hybri-MaxTM Sigma，Cat．No H0137;Anti-Mouse IgG，Sigma，Cat．No A4416;Freund’s complete adjuvant(FCA)Sigma， Cat． No． F5881;OPhenylenediaminedihydrochloride(OPD)，Sigma，Cat．No P9187。

1.3 IgG制備及純度鑒定

采用飽和硫酸銨鹽析和Agarose-Protein G親和層析分離純化，按文獻(xiàn)［9］的方法，取10 mL食蟹猴血清和40 mL冷的50 mmol/L PBS(pH7.2)緩沖液，在冰上加入硫酸銨粉末，邊加邊攪拌，最終濃度在22%，離心去除沉淀，上清液繼續(xù)加入硫酸銨粉末終濃度55%，在4℃下放置4 h，離心回收沉淀，并溶解在50 mmol/L磷酸鹽緩沖液中，透析在50 mmol/L磷酸鹽緩沖液中，中間三次換液并過夜透析。次日回收透析液，離心除去不溶物。上清液加入硫酸銨粉末至終濃度33%，在4℃下攪拌并靜止4 h，離心收集沉淀，透析于20 mmol/L磷酸鹽中，換液3次并過夜，回收透析液，并12000 rpm離心10 min，去掉不溶性蛋白備用。層析法是將Agarose-PreoteinG在超純水中膨脹30～60 min后裝柱，經(jīng)5～10倍體積的20 mmol/L磷酸鹽平衡后，上柱、洗脫，并收集洗脫液定量。用SDS-PAGE對提純的IgG純度進(jìn)行鑒定，純化后的IgG－80℃保存。

1.4 小鼠免疫及細(xì)胞融合

取6～8周齡雌性 C57BL/6小鼠，初次免疫為FCA乳化抗原，皮下多點(diǎn)注射，抗原用量為250 ug/只，間隔2周，進(jìn)行FIA加強(qiáng)免疫1次，第3次用純化的IgG腹腔直接免疫，4 d后取脾臟，分離細(xì)胞，骨髓瘤細(xì)胞1×107個(gè)/mL與已免疫的小鼠脾細(xì)胞1×108個(gè)/mL混合，用 50%的 PEG4000/RMPI-1640進(jìn)行融合制備雜交瘤。

1.5 雜交瘤細(xì)胞的篩選

按常規(guī)間接ELISA方法，融合10 d后，以100 ng/孔純化后的食蟹猴IgG作檢測抗原包被ELISA板，3%BSA封閉1 h，取融合細(xì)胞上清液進(jìn)行檢測，并以SP2/0培養(yǎng)上清和免疫小鼠血清分別做陰陽性對照，加二抗，顯色，ELISA讀數(shù)，判定標(biāo)準(zhǔn)為P/N＞2.1為陽性。采用有限稀釋法對所選擇陽性雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行連續(xù)3次克隆，3次克隆化后結(jié)果均為陽性者，判斷為能穩(wěn)定分泌抗食蟹猴IgG抗體的雜交瘤細(xì)胞株。擴(kuò)大培養(yǎng)并分批凍存雜交瘤細(xì)胞。

1.6 單克隆抗體(McAb)的免疫原性檢測

McAb的免疫原性通過Western blot檢測，取純化后及粗提的食蟹猴 IgG進(jìn)行 SDS-PAGE;通過半干轉(zhuǎn)移法轉(zhuǎn)移到 PVDF膜上，3%BSA 37℃封閉1 h;在搖床上用 PBST洗膜5次，然后分別與雜交瘤2B6、2B7、2D9、3B2、5E4上清 37 ℃ 作用 1 h，清洗;再與HRP標(biāo)記的羊抗鼠 IgG 37℃作用1 h，清洗;ECL-Kit顯色后，立即暗室曝光、洗相。

1.7 McAb腹水制備及效價(jià)的測定

按照常規(guī)方法，選8～10周齡 C57BL/6小鼠腹腔每只注射0.5 mL液體石蠟。7 d后，以1×106個(gè)雜交瘤細(xì)胞/mL，0.5 mL每只小鼠，腹腔注射。一般7～10 d左右，便可以采集腹水。取得腹水后，腹水經(jīng)離心、硫酸銨沉淀、Protein G-Agarose親合層析純化得到純度較高的單克隆抗體。然后通過間接ELISA方法進(jìn)行效價(jià)測定，100ng/孔包被食蟹猴IgG，方法同雜交瘤細(xì)胞的篩選。

1.8 McAb特異性鑒定

通過間接ELISA，以犬血清、貉血清、東北虎血清、恒河猴血清各50 uL/孔以及純化后的 IgG各100 ng/孔作為抗原包被酶標(biāo)板，以雜交瘤培養(yǎng)上清為一抗，方法同雜交瘤細(xì)胞的篩選。同時(shí)以純化后的犬、貉、東北虎、獼猴免疫球蛋白，通過 SDS-PAGE電泳與 Western blot鑒定 MAb的特異性，方法同McAb的免疫原性檢測。

1.9 McAb亞型鑒定

單克隆抗體的亞型的鑒定，參照 SBA ClonotypingTMSystem/HRP說明書所描述方法進(jìn)行操作。

2 結(jié)果

2.1 SDS-PAGE鑒定IgG

經(jīng)飽和硫酸銨沉淀得粗提食蟹猴IgG和經(jīng)Protein G-Agarose親和層析后食蟹猴IgG通過SDSPAGE電泳后，結(jié)果如圖1所示，重鏈的分子量約55×103，輕鏈約28×103，符合哺乳動(dòng)物的 IgG的分子量。

2.2 McAb免疫活性檢測

采用Western blot法檢測5株單克隆抗體與粗提、純化后的食蟹猴 IgG的結(jié)合活性，結(jié)果表明2B6、5E4、2B7、2D9、3B2均與重鏈反應(yīng)，5 株雜交瘤均具有良好的免疫活性。

圖1 SDS-PAGE IgG鑒定Fig．1 SDS-PAGE identify the IgG

2.3 McAb腹水效價(jià)

小鼠腹水經(jīng)純化后，2D9、3B2的腹水效價(jià)分別為 1∶25600，1∶51200。2B7、5E4、2B6的 ELISA 效價(jià)為1∶12800，雜交瘤細(xì)胞經(jīng)多次傳代凍存復(fù)蘇，誘生腹水抗體分泌特性穩(wěn)定。

2.4 McAb特異性鑒定

McAb與純化后的食蟹猴、恒河猴 IgG，食蟹猴血清、恒河猴血清均反應(yīng)，而與東北虎、犬的血清及其IgG均不反應(yīng)。說明食蟹猴與恒河猴IgG具有相同的抗原表位，如表1可見。

2.5 McAb亞型鑒定

用單克隆抗體亞型鑒定試劑盒測定雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清中單克隆抗體的亞型，結(jié)果表明5E4、2B6、2B7為 IgG2b 型，3B2為 IgG3 型，2D9為 IgG1 型。2B7、2B6、5E4、2D9輕鏈均為 κ 型，3B2 為 λ 型。

表1 ELISA鑒定結(jié)果Tab．1 Result of ELISA evaluation

3 討論

據(jù)2009年統(tǒng)計(jì)，我國實(shí)驗(yàn)猴的存欄量21萬只，其中恒河猴近3萬只，食蟹猴18萬余只［11］。食蟹猴、恒河猴因與人類有很近的親源關(guān)系，遺傳基因相似，廣泛應(yīng)用于人類醫(yī)學(xué)研究，是重要的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，但是由于攜帶多種疾病，因此需要加強(qiáng)非人靈長類的疾病檢測，保證實(shí)驗(yàn)順利開展至關(guān)重要。

為此，從食蟹猴血清中，通過飽和硫酸銨沉淀和親和層析技術(shù)，由SDS-PAGE檢測結(jié)果表明所得到的食蟹猴IgG純度較高。雖然粗提條帶相對于親和層析有少量雜帶，但其純度仍相當(dāng)客觀，所以在需要制備大量粗提抗體時(shí)，加入固體飽和硫酸銨沉淀法從儀器設(shè)備、溫度、價(jià)格、活性、純度等方面考慮，有很大優(yōu)勢，值得推廣使用。而親和層析法相對于其他提純方法價(jià)格雖比較昂貴，但其可以在簡單的試驗(yàn)條件里，快速得到所需高純度樣品。二者聯(lián)合運(yùn)用，即經(jīng)濟(jì)，效果也客觀，在制備各種動(dòng)物免疫球蛋白二級(jí)抗體方面，可優(yōu)先考慮。

本研究利用細(xì)胞融合技術(shù)，成功制備了5株能穩(wěn)定分泌抗食蟹猴IgG的雜交瘤細(xì)胞。從單克隆特異性鑒定結(jié)果表明，每孔均包被100 ng純化后的IgG，這5株雜交瘤所分泌單克隆抗體均與食蟹猴、恒河猴純化后的IgG、血清反應(yīng)，差別是血清反應(yīng)性較純化的IgG弱些，有可能跟血清中IgG相對濃度比純化后的濃度低有關(guān)。食蟹猴、恒河猴兩個(gè)物種的反應(yīng)強(qiáng)度相似，說明食蟹猴、恒河猴IgG具有較高的共同抗原表位。這可能與它們親緣關(guān)系較近有關(guān)。單克隆抗體為以后研究這兩種實(shí)驗(yàn)動(dòng)物疾病血清學(xué)診斷、人IgG特性比對，提供了基礎(chǔ)。

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Preparation Monoclonal Antibodies Of Mice Against Macaca fascicularis IgG

ZHANG Duan-ling，ZHANG Yan-long，BAI Su-ying
(Northeast Forestry University，Harbin 150040，China)

ObjectiveIn order to prepare immunoglobulin G(IgG)secondary antibody of non-human primates such as Macaca fascicularis and Macaca mulatta and establish a quick serological method to diagnose their diseases．MethodsMacaca fascicularis IgG was isolated and purified from Macaca fascicularis serum by precipitated use saturated ammonium sulfate and affinity chromatography technology with Agarose-Protein G．After identified by SDS-PAGE electrophoresis murine monoclonal antibody(McAb)were produced by conventional immune method and hybridoma technology．Monoclonal antibody was produced when C57BL/6 mice was immunized three times and its spleen cells were fused with SP2/0-Ag14 myeloma cells．Indirect ELISA and Western blot methods were used for identification．Result5 strains of myeloma cells acquired which were named 2B6，2B7，3B2，5E4，2D9．The antibodies they secret can all react well with both IgG and their serum of Macaca fascicularis and Macaca mulatta．There are no cross reaction with other species such as east-northern tigers and dogs．ConclusionThe 5 strains of monoclonal antibodies can secrete antibody chronically and steadily．The study can be valuable in establishing a quick serological method in diagnosing the infectious disease．

Macaca fascicularis;IgG;Affinify chromatography;Monoclonal antibody

R332

】A

1671-7856(2012)05-0068-04

10．3969/j．issn．1671．7856．2012．05．015

國家林業(yè)局疫源疫病監(jiān)測項(xiàng)目《我國境內(nèi)不同種屬猴免疫球蛋白同源性分析及其單克隆抗體的制備》。

張段玲(1988－)，女，碩士，研究方向:動(dòng)物傳染病。

張彥龍(1968－)，E-mail:zhangynlng@yahoo．com．cn。

2012-03-23