Raynald，李延濱，郭牧遙，黃 華，張 涵，于 昊，李海龍，崔福齋，安沂華

（1.首都醫(yī)科大學(xué)，北京市神經(jīng)外科研究所，北京 100050；2.清華大學(xué)材料科學(xué)與工程系，北京 100084）

脊髓損傷是一種嚴重危害人類健康的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病，可導(dǎo)致感覺和運動功能喪失，目前對其后遺癥缺乏有效的治療手段。隨著干細胞及組織工程學(xué)技術(shù)的發(fā)展，細胞復(fù)合生物材料移植治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷得到了更多的關(guān)注。本研究利用骨髓間充質(zhì)干細胞作為種子細胞，透明質(zhì)酸—多聚賴氨酸材料作為支架，研究其復(fù)合物對脊髓損傷的修復(fù)效果。

1 材料和方法

1.1 材料

Spraque Daw ley（SD）大鼠（中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物研究所SCXK（京）2009-0017）；細胞培養(yǎng)試劑：DMEM，10％牛血清（GIBCO Company）；手術(shù)器械：YZ20P5手術(shù)顯微鏡（蘇州六六視覺科技股份有限公司）；倒置顯微鏡（Nikon）；電鏡（Hitachi TEM system）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)：將5 mL已抗凝的人骨髓與等體積PBS混合，室溫下900 g離心10 min，沉淀物用PBS洗2次；細胞重懸，密度為4×107/mL；密度梯度離心法分離單個核細胞，重懸于DMEM（低糖）+ 15％胎牛血清培養(yǎng)基中，置于37℃、5％CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；每3～4 d換一次培養(yǎng)基；細胞至90％融合時，0.25％胰酶/EDTA消化，傳代培養(yǎng)；

1.2.2 透明質(zhì)酸-多聚賴氨酸（HA-PLL）材料的制備：HA在EDC（碳化二亞胺，1-（3-dimethylam inopropyl）-3-ethylcarbodiim ide）的介導(dǎo)下與PLL反應(yīng)，避光過夜保存，溶液緩慢交聯(lián)成凝膠；將上述凝膠用去離子水在超聲波中清洗三次去除殘留物，-20℃冷凍后放入凍干機內(nèi)進行冷凍干燥。48 h后得到多孔框架材料［1］。

1.2.3 實驗動物分組：體重200～220 g的雌性SD大鼠32只，隨機分為4組，單純損傷組（8只）、hBMSC移植組（8只）、HA-PLL移植組（8只）、hBMSC-HA-PLL移植組（8只）。

1.2.4 脊髓半橫斷模型的制作：水合氯醛（0.4 m L/100 g）腹腔注射麻醉。取俯臥位，無菌狀態(tài)下充分暴露T6-T7節(jié)段的脊髓，將其半橫斷，縱向去除脊髓組織的長度為2 mm，然后根據(jù)分組情況，將hBMSC、材料或hBMSC+材料植入脊髓缺損區(qū)域，逐層縫合。

1.2.5 大鼠運動功能的檢測：于術(shù)后8周內(nèi)每周1次觀察大鼠運動功能恢復(fù)情況。評價方法參照BBB運動評分法［2］。

1.2.6 損傷部位形態(tài)學(xué)評價：術(shù)后8周殺死大鼠，利用電鏡觀察各組損傷局部是否有新生軸突和血管出現(xiàn)，并比較其形態(tài)差別。

1.2.7 統(tǒng)計學(xué)分析：大鼠運動功能的評分用平均值±標準差表示（±s），使用SPSS軟件進行重復(fù)測量方差分析，P＜0.05表示為有顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 動物行為學(xué)恢復(fù)情況

動物行為學(xué)變化主要是觀察損傷側(cè)下肢運動功能的恢復(fù)情況。觀察運動功能行為分為3個階段：早期主要觀察后肢關(guān)節(jié)的運動，中期主要觀察平衡能力與步態(tài)運動，晚期主要觀察下肢足部精細運動。8周內(nèi)觀察可見，HA-PLL組大鼠的運動功能與單純損傷組相比評分差異無統(tǒng)計學(xué)意義，hBMSC移植組的運動功能恢復(fù)程度明顯好于上述兩組（P＜0.05），hBMSC-HA-PLL組的運動功能恢復(fù)程度則明顯好于單純損傷組及HA-PLL組（P＜0.05），但與hBMSC移植組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（表1）。從恢復(fù)的時間段來看，在損傷后急性期改善程度較亞急性期顯著。4組中，hBMSC組及hBMSC-HAPLL移植組恢復(fù)的速度最快，尤其是在第一周時明顯高于對照組及HA-PLL組，兩周后對照組及HAPLL組也出現(xiàn)明顯的恢復(fù)，而hBMSC組及hBMSCHA-PLL組的恢復(fù)速度則有所減慢，但評分仍要好于對照組及HA-PLL組，而到5周以后各組的恢復(fù)程度幾乎沒有明顯變化（圖1）。

表1 表1 脊髓損傷術(shù)后1至8周BBB評分各組變化Tab.1 1st week to 8th week post-spinal cord injury each group BBB score

圖1 脊髓損傷術(shù)后1至8周BBB評分各組變化Fig.1 1st week to 8th week post-spinal cord injuryeach group BBB score

2.2 電鏡評價損傷局部形態(tài)

利用電鏡觀察新生軸突和血管生長情況。電鏡結(jié)果顯示：HA-PLL移植組和hBMSC-HA-PLL移植組，在有材料存在的脊髓損傷區(qū)域，可見新生神經(jīng)纖維，包括有髓纖維和無髓纖維，其中大部分的新生神經(jīng)纖維有施萬細胞圍繞（彩插2圖2），與HA-PLL組相比，hBMSC-HA-PLL組新生軸突的數(shù)量要更多，軸突的髓鞘形態(tài)較為完整，板層明暗相間，結(jié)構(gòu)清晰，軸漿內(nèi)細胞器豐富，且未見明顯髓鞘變性，兩組的材料內(nèi)部都偶見新生血管形成，血管形態(tài)基本正常，血管內(nèi)皮細胞生長良好（彩插2圖3）。單純損傷組的損傷區(qū)域主要被膠原和纖維細胞填充，偶見有孤立的新生軸突生成，但生長欠佳，而在有材料植入的損傷區(qū)域膠原及纖維細胞明顯減少。在單純細胞移植組，損傷局部也有新生神經(jīng)纖維生成，新生軸突的髓鞘也較完整，但與HA-PLL移植組及hBMSC-HA-PLL移植組相比，其膠原及纖維細胞的成分更多，膠質(zhì)瘢痕的生成更為豐富，但少于單純損傷組。

3 討論

脊髓損傷后，軸突的再生能力極為有限，因而此類患者往往遺留有嚴重的終生殘疾。如何有效促進此類患者損傷的中樞神經(jīng)的再生，改善其神經(jīng)功能，成為目前國際上的研究熱點。國內(nèi)外許多研究證明，hBMSC在中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷修復(fù)中具有巨大潛力。hBMSC具有干細胞多向分化和自我更新的潛能，且獲取途徑避免了相關(guān)倫理學(xué)爭議，體外擴增相對簡便且性質(zhì)穩(wěn)定，擁有更加廣闊的臨床應(yīng)用前景。本研究選擇hBMSC作為種子細胞，結(jié)合組織工程學(xué)技術(shù)治療大鼠脊髓損傷。

脊髓損傷導(dǎo)致神經(jīng)元及膠質(zhì)細胞死亡、功能喪失以及膠質(zhì)疤痕形成，膠質(zhì)疤痕主要由反應(yīng)性星形膠質(zhì)細胞組成，可阻礙軸突再生和延伸［3，4］。上述改變在單純損傷組中有所體現(xiàn)。本研究采用多孔的HA-PLL水凝膠作為支架，希望其材質(zhì)可有利于神經(jīng)功能的恢復(fù)：其多孔的表面形態(tài)有利于細胞的貼附和生長。在有材料存在的組中可見：材料移植區(qū)損傷區(qū)域變窄，其內(nèi)有新生軸突和血管，同時可見動物在行為學(xué)方面有所恢復(fù)［5-7］。上述結(jié)果說明，HA-PLL水凝膠在一定程度上可以減輕膠質(zhì)瘢痕的形成，為軸突再生和移植細胞發(fā)揮作用提供相對良好的微環(huán)境，這與其他相關(guān)研究的結(jié)果基本一致。其機制可能包括：HA-PLL水凝膠的存在可以維持組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)；在細胞生長和物質(zhì)交換方面起到重要作用，有利于損傷軸突的再生；同時材料本身的材質(zhì)可以消除細胞周圍的水腫、誘導(dǎo)新生血管的形成，進一步促進軸突的再生［8-10］。

本研究結(jié)果顯示，有干細胞移植的兩組動物損傷恢復(fù)程度更好。BBB評分顯示脊髓損傷后急性期，hBMSC組和hBMSC-HA-PLL組評分顯著高于對照組和HA-PLL組，在亞急性期評分也略微高于后兩組。而8周時的BBB評分表明，HA-PLL組大鼠的運動功能與單純損傷組相比評分差異無統(tǒng)計學(xué)意義，而hBMSC移植組和hBMSC-HA-PLL組的運動功能恢復(fù)程度明顯好于沒有移植細胞的兩組（表1，P＜0.05）。已知hBMSC可分泌許多營養(yǎng)因子包括腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（BDNF）、神經(jīng)營養(yǎng)因子-3 （NT-3）、血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）、神經(jīng)生長因子（NGF）、堿性成纖維細胞生長因子（bFGF）、胰島素生長因子-1（IGF-1），等等。這些神經(jīng)營養(yǎng)因子對神經(jīng)系統(tǒng)的損傷修復(fù)發(fā)揮著重要作用。推測這些hBMSC分泌的細胞因子和細胞外基質(zhì)促進了損傷軸突的再生、填充損傷區(qū)域并恢復(fù)脊髓的信號傳導(dǎo)、減輕膠質(zhì)疤痕對軸突延伸的抑制效應(yīng)，從而促進神經(jīng)修復(fù)［3，4，11-14］。

雖然HA-PLL材料本身的確可以改善損傷微環(huán)境，有利于神經(jīng)再生。但在本研究中，四組的BBB評分統(tǒng)計學(xué)分析表明，HA-PLL似乎對神經(jīng)修復(fù)并無影響，推測有以下兩種可能：一是HA-PLL本身對神經(jīng)修復(fù)的影響不如干細胞顯著；二是BBB評分對神經(jīng)功能的評價不如神經(jīng)電生理檢查敏感，雖然可以檢測出比較明顯的神經(jīng)功能差異，但對不甚明顯的差異可能表現(xiàn)欠佳。這一點在我們隨后的實驗研究中已經(jīng)得到初步證實（數(shù)據(jù)未顯示）。

綜上所述，聯(lián)合應(yīng)用hBMSC-HA-PLL能夠促進大鼠運動功能的恢復(fù)，其具體機制仍需要進一步的深入研究。

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