施海霞，陳 煒，鄧 巍，梁 虹

（中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院，北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院，醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物研究所衛(wèi)生部人類疾病比較醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100021）

本課題組利用造血干細(xì)胞囊胚顯微注射法構(gòu)建了人源化小鼠造血嵌合體模型，在2月齡人源化小鼠中仍可檢測到人源化細(xì)胞的存在［2］，但2月齡雄性人源化小鼠中出現(xiàn)顯著的疝氣癥狀。本文對疝氣的病因、對動物生理、行為表型及對模型應(yīng)用的潛在影響進(jìn)行了研究。

1 材料和方法

1.1 人造血干祖細(xì)胞制備

正常健康新生兒臍血由北京市臍帶血造血干細(xì)胞庫提供（孕母排除病毒性肝炎、艾滋病和梅毒感染）。臍血用肝素鈉抗凝，12 h內(nèi)分選。用Ficoll Paque PLUS淋巴細(xì)胞分離液（密度1.077，GE Healthcare公司）以不連續(xù)密度梯度離心，收集界面白膜層懸浮細(xì)胞即為臍血單個核細(xì)胞（MNC），MNC再經(jīng)EasySep復(fù)選人造血干祖細(xì)胞（含CD41）試劑盒（stemcell公司）分選獲得人造血干祖細(xì)胞。

1.2 干細(xì)胞囊胚顯微注射

以3～4周齡ICR雌鼠作為囊胚供體鼠。采用PMSG和hCG進(jìn)行超排處理，第2.5天取桑椹胚，KSOM液培養(yǎng)過夜，次日囊胚充分?jǐn)U張后進(jìn)行造血干細(xì)胞的顯微注射，每個囊胚內(nèi)注射15～20枚造血干細(xì)胞，移植入假孕鼠2.5 d子宮中。

1.3 人源化小鼠的鑒定

小鼠出生后9～14 d剪尾，堿裂解法提取基因組DNA，用人線粒體DNA特異性引物進(jìn)行PCR檢測：hm tDNA-FP：5＇CAC CCT ATT AAC CAC TCA CG 3＇；hmtDNA-RP：5＇ATG TCT GTG TGG AAA GCG 3＇，擴(kuò)增產(chǎn)物大小為264 bp。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性3 min，94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，40個循環(huán)，72℃延伸10 min。

Michael Mauer:優(yōu)秀的設(shè)計(jì)源自于“天馬行空”一般的創(chuàng)意，但它們最終要回歸到源于紀(jì)律、架構(gòu)、目標(biāo)等略顯枯燥的細(xì)化階段。在這個階段，除了自由和創(chuàng)意，我們還需要勤奮、認(rèn)真和嚴(yán)謹(jǐn)?shù)墓ぷ鲬B(tài)度。就像我剛才說的，設(shè)計(jì)師可以用感性的方式來創(chuàng)新，但也必須要具備理性的思維來實(shí)踐。好的設(shè)計(jì)師就像一名經(jīng)驗(yàn)豐富的運(yùn)動員，擁有十分準(zhǔn)確的預(yù)判技巧，也有著沉著、冷靜的執(zhí)行能力。設(shè)計(jì)雖然能夠令人沉醉其中，但我也不否認(rèn)，做一名優(yōu)秀的設(shè)計(jì)師其實(shí)很辛苦。

1.4 病理學(xué)觀察

小鼠斷頸處死，取5只疝氣癥狀的人源化陽性小鼠和5只野生型小鼠的腹股溝區(qū)和陰囊組織，10％中性福爾馬林（neutral buffered formalin，NBF）固定，脫水，石蠟包埋，切片厚度10μm，Masson染色觀察膠原纖維含量。采用特異性人CD45抗體（abcom ab8216）進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，檢測相應(yīng)組織中人源化細(xì)胞的表達(dá)。

1.5 行為學(xué)檢測

選用2月齡的人源化陽性和陰性雄性小鼠各9只，野生型小鼠10只，采用modified SHIRP進(jìn)行行為學(xué)初篩［3］。隨后采用Rota-rod轉(zhuǎn)輪測試儀（UGO公司，意大利）進(jìn)行小鼠運(yùn)動與耐力測定，參數(shù)設(shè)置：最小速度為5 rpm，最大速度為20 rpm，加速度時間為5 min，將實(shí)驗(yàn)小鼠分別放到相應(yīng)的跑道上，開啟儀器，記錄動物的爬行持續(xù)時間。最后，采用Morris水迷宮進(jìn)行運(yùn)動型和游泳耐力測定，水溫25℃，記錄動物在1m in內(nèi)的游泳距離、速度和活躍期時間。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用平均值±SE表示，并用SPSS軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，數(shù)據(jù)經(jīng)正態(tài)分布和方差齊性檢驗(yàn)后，采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)對人源化陽性組合野生型對照組數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，采用one-way ANOVA分析對陽性組、陰性組和野生對照組數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。當(dāng)P＜0.05時為差異顯著。

2 結(jié)果

本研究通過干細(xì)胞顯微注射法將人臍血干祖細(xì)胞注射到小鼠囊胚中，成功獲得了人源細(xì)胞嵌合體小鼠，嵌合體陽性率為23％［2］。在20只人源化雄性小鼠中，有90％的個體出現(xiàn)程度不一的疝氣癥狀，本研究對這些疝氣癥狀小鼠進(jìn)行了病理學(xué)、生理學(xué)和行為學(xué)表型分析：

1.病理觀察

我們解剖了5只2月齡以上的雄性小鼠，小鼠的體表外觀上可見程度不等的陰囊腫脹，剪開疝囊，內(nèi)容物包括小腸、大腸、膀胱等腹部臟器（彩插8圖1），這些內(nèi)容物不可回縮至腹腔。

鏡下Masson染色顯示，與野生型小鼠相比，人源化嵌合體小鼠腹膜腹股溝區(qū)致密結(jié)締組織減少（彩插8圖2）。但免疫組化研究結(jié)果表明，這些病變組織中不存在人源化細(xì)胞。

2.睪丸系數(shù)與血液激素含量

人源化嵌合體陽性和陰性及野生型雄性小鼠的睪丸系數(shù)（F2，10=2.982，P=0.108）、血液睪酮（F2，10=0.009，P=0.991）和皮質(zhì)酮（F2，10=0.008，P =0.992）濃度之間均無顯著差異。

表1 人源化小鼠繁殖系統(tǒng)功能Tab.1 Mean values of reproductive system function

3.運(yùn)動行為學(xué)

對人源化小鼠行為學(xué)初篩表明，在尾巴姿勢和反抗行為這兩個指標(biāo)上，人源化小鼠、人源化陰性小鼠和野生型小鼠之間具有顯著差異（尾巴姿勢：F =3.571，P=0.043；反抗行為：F=3.551，P= 0.044），其中，人源化小鼠的尾巴姿勢得分顯著高于野生型小鼠（P=0.014），人源化小鼠尾巴上翹的比例高于野生型小鼠，這可能是因?yàn)殛幠夷[大引起的尾巴姿勢變化，而不代表動物的應(yīng)激性升高。人源化小鼠的逃逸行為（P=0.03）和反抗行為（P =0.015）顯著低于陰性嵌合小鼠。人源化小鼠的正位反射（P=0.034）高于野生型小鼠。人源化小鼠的抓力（P=0.027）顯著低于野生型小鼠，表明小鼠的后肢運(yùn)行協(xié)調(diào)性下降（表2）。

在Rota-rod轉(zhuǎn)輪實(shí)驗(yàn)中，各組之間具有顯著差異（F2，25=4.330，P=0.024）。其中，陽性和人源化陰性小鼠在轉(zhuǎn)棒上的運(yùn)動持續(xù)時間均顯著低于野生型小鼠（P=0.03；P=0.012）。

各組小鼠在游泳距離（F2，26=3.572，P= 0.043）、速度（F2，26=3.546，P=0.043）上具有顯著差異，人源化小鼠的游泳距離和速度顯著低于野生型小鼠（P=0.014）而各組小鼠的活躍期時間（F2，26=1.373，P=0.271）無顯著差異。

表2 Modified SHIRPA行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.2 Behavior anaylsis in modified SHIRPA

表3 Rota-rod轉(zhuǎn)輪實(shí)驗(yàn)Tab.3 The Rota-rod Test

3 討論

恥骨肌孔（myopectineal orifice）是一個位于腹股溝區(qū)的卵圓形裂孔，僅以一層腹橫筋膜結(jié)締組織抵抗腹腔內(nèi)壓力，這部位區(qū)域的薄弱會引起疝氣形成［4］。本研究表明人源化小鼠腹股溝區(qū)致密結(jié)締組織減少，致密結(jié)締組織是筋膜鞘的主要組分，因此致密結(jié)締組織的減少可能是疝氣形成的直接原因。并且，疝氣僅在2月齡以上成年雄性個體中發(fā)生。因此，人源化小鼠疝氣表型屬于直接性腹股溝疝。

研究發(fā)現(xiàn)睪丸和精索由腹股溝管下降到陰囊的過程受雄激素的調(diào)節(jié)，兒童可因疝氣的擠壓而影響睪丸的正常發(fā)育［5，6］。本研究結(jié)果表明人源化小鼠的疝氣癥狀不影響睪丸的大小和功能，疝氣發(fā)生與睪酮變化無顯著相關(guān)性，這與人類男性腹股溝疝的發(fā)生與雄激素變化無關(guān)的結(jié)果相一致［7，8］。而在形成間接腹股溝疝的Insl3轉(zhuǎn)基因小鼠中，鞘狀突的形成與雄激素介導(dǎo)的睪丸引帶外突也無相關(guān)性。

人類疝氣患者具有易疲勞和體質(zhì)下降等癥狀。本研究也發(fā)現(xiàn)，造血干細(xì)胞人源化小鼠的運(yùn)動機(jī)能和耐力均顯著下降，但與運(yùn)動興奮性相關(guān)的皮質(zhì)酮激素含量卻無顯著變化。以往對人源化小鼠的相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，恒河猴骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞嵌合體小鼠在懸尾實(shí)驗(yàn)時具有四肢抱攏的反常現(xiàn)象［9］。而在本研究中，modified SHIRPA行為觀察發(fā)現(xiàn)，人源化小鼠的正位反射高于野生型小鼠，即懸尾狀態(tài)下動物頭部抬起概率增加。這與上述現(xiàn)象不同，但均說明嵌合體小鼠的神經(jīng)系統(tǒng)或運(yùn)動系統(tǒng)中存在某種異常反射。提示在神經(jīng)系統(tǒng)或運(yùn)動系統(tǒng)中有異源動物細(xì)胞嵌合，靈長類與小鼠神經(jīng)細(xì)胞及神經(jīng)系統(tǒng)反射機(jī)制的巨大差別可能是前述現(xiàn)象發(fā)生的原因。

異種動物造血嵌合體模型在人造血干細(xì)胞體內(nèi)生物學(xué)特性、人類免疫相關(guān)疾病及其它應(yīng)用研究方面具有巨大的應(yīng)用潛力。目前常見的重癥聯(lián)合免疫缺陷小鼠干細(xì)胞移植系統(tǒng)在人類免疫系統(tǒng)功能塑造方面存在一定局限。在免疫系統(tǒng)尚未成熟的胚胎發(fā)育早期進(jìn)行的人源干細(xì)胞顯微注射嵌合體小鼠是方法學(xué)上的一種新突破，對這種人源化小鼠的表型分析是該模型進(jìn)一步應(yīng)用的基礎(chǔ)，本研究結(jié)果表明人源化小鼠的疝氣表型對于小鼠運(yùn)動性和耐力具有顯著抑制，但不影響小鼠的繁殖系統(tǒng)功能。

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