孫立新

（天津市乳品食品監(jiān)測(cè)中心，天津 300381）

四環(huán)素類抗生素具有廣譜的抗菌作用，經(jīng)常用于預(yù)防和治療奶牛的乳腺炎、子宮炎[1]。但是有研究證明，四環(huán)素類抗生素可通過(guò)奶的攝入進(jìn)入人體，導(dǎo)致人的毒副作用及過(guò)敏反映[2]。為了保護(hù)人類健康，世界衛(wèi)生組織（WHO）、美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）以及歐共體（EU）等都限定了奶中四環(huán)素類抗生素的殘留量，如土霉素的最大殘留量為0.1μg/mL，以切實(shí)保證人類的食品安全[3]。

20世紀(jì)90年代，四環(huán)素類藥物殘留的分析方法主要有微生物法、薄層色譜法、毛細(xì)管電泳法、高效液相色譜法和液譜-質(zhì)譜聯(lián)機(jī)法[4-6]等，但是這些方法中，或存在檢測(cè)靈敏度低、或存在檢測(cè)方法所需儀器設(shè)備復(fù)雜昂貴等缺陷，難以滿足實(shí)際檢測(cè)工作的需要[7-9]。

本研究以當(dāng)前食品檢測(cè)普遍采用的高效液相色譜儀為手段，通過(guò)建立適當(dāng)?shù)奶崛『图兓椒?、?yōu)化色譜分析方法，以實(shí)現(xiàn)乳中三種四環(huán)素類抗生素的同時(shí)檢測(cè)分析。

1 材料與方法

實(shí)驗(yàn)材料：牛奶樣品，采自農(nóng)場(chǎng)生鮮牛乳。

1.1 儀器與試劑

高效液相色譜儀（美國(guó)waters公司，600E型），配備996型二極管陣列檢測(cè)器（PDA），pHs－25酸度計(jì)（上海精密科學(xué)儀器公司）；紫外分光光度計(jì)（UNICAM，）；離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；渦旋振蕩器。

C18固相萃取柱（Warian Bond Elut，100 mg/1 mL）。

四環(huán)素（tetracycline,TC）、土霉素（oxytetracycline,OTC）、金霉素（chlortetracycline,CTC）由中國(guó)藥品生物制品檢定所提供；甲醇、乙腈（色譜純）；水為超純水；檸檬酸、乙二氨四乙酸二鈉（Na2EDTA）、磷酸氫二鈉（分析純）。

1.2 色譜條件

色譜柱為Nova-PakC18（美國(guó)waters公司，150mm×3.9 mm×4.5μm）。

采用草酸0.01 mol/L（pH=2.0）—乙腈—甲醇三元梯度洗脫，洗脫程序?yàn)椋?00%草酸1 min，5 min內(nèi)變?yōu)椴菟帷靡译妗眉状迹?0∶8∶22，并維持 10 min。

流動(dòng)相流速為0.8 mL/min，進(jìn)樣量20μL，室溫檢測(cè)，檢測(cè)波長(zhǎng)360 nm。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 溶液的配制

準(zhǔn)確稱取10 mg TC、OTC、CTC標(biāo)準(zhǔn)品，分別用甲醇定容到100 mL棕色容量瓶中，作為標(biāo)準(zhǔn)貯備液。吸取一定量的標(biāo)準(zhǔn)貯備液用0.01 mol/L的草酸甲醇稀釋到適當(dāng)濃度配制標(biāo)準(zhǔn)工作液。

MCI-Vaine 緩沖液[10]：準(zhǔn)確稱取Na2HPO428.41 g，用水溶解，定容到1000 mL容量瓶中，簡(jiǎn)稱溶液A。準(zhǔn)確稱取檸檬酸21.00 g，用水溶解，定容到1000 mL容量瓶中，簡(jiǎn)稱溶液B。取625 mL溶液A和1000 mL溶液B混勻，以酸度計(jì)調(diào)節(jié)pH至4.0+0.1。

MCI-Vaine-Na2EDTA緩沖液：準(zhǔn)確稱取Na2EDTA 60.49g溶解于1625mL的MCI-Vaine液中，配成0.01mol/L Na2EDTA的MCI-Vaine緩沖液。

0.01 mol/L草酸溶液：準(zhǔn)確稱取草酸1.26 g，用水溶解并定容于1000 mL容量瓶中。以酸度計(jì)調(diào)節(jié)pH=2.0。

0.01 mol/L草酸甲醇溶液：準(zhǔn)確稱取草酸1.26 g，用甲醇溶解并定容于1000 mL容量瓶中。

1.3.2 樣品處理

準(zhǔn)確量取2 mL巴氏消毒奶置于離心管中，加入2 mL MCI-Vaine-Na2EDTA緩沖液，在渦旋振蕩器上振蕩 2 min，離心（5000 r/min）10 min，小心傾出上清液。在沉淀中再加入2 mL MCI-Vaine-Na2EDTA緩沖液，同樣方法提取、離心。提取液合并后，用預(yù)先活化的C18固相萃取柱進(jìn)行純化、富集，吸附速度控制在1mL/min，以3 mL蒸餾水淋洗后，用1 mL的0.01 mol/L草酸甲醇洗脫。洗脫液經(jīng)0.45μm濾膜過(guò)濾后進(jìn)行HPLC分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 提取溶劑的選擇

四環(huán)素類抗生素屬于酸堿兩性物質(zhì)，易與蛋白質(zhì)強(qiáng)烈結(jié)合，提取時(shí)需要用酸性物質(zhì)將蛋白脫除。由于四環(huán)素類抗生素在酸性（pH<2.0）或堿性（pH>7）的條件下中易發(fā)生降解，在弱酸性溶液中相對(duì)穩(wěn)定。因此，本實(shí)驗(yàn)選用了含有EDTA的弱酸性溶劑0.1 mol/L EDTA-McIlvaine緩沖液（pH4.0）作為提取溶劑。

2.2 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇見(jiàn)圖1。利用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)在190 nm～400 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，得到3種四環(huán)素類抗生素的吸收?qǐng)D譜，發(fā)現(xiàn)3種抗生素有相似的吸收光譜，在268 nm和350 nm處各有一個(gè)吸收峰。分別在兩個(gè)波長(zhǎng)下進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)在360 nm下基質(zhì)干擾最小，基線平穩(wěn)，所以選擇360 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)。

圖1 3種四環(huán)素掃描光譜圖Fig.1 Scanning spectrum of 3 tetracyclines

2.3 流動(dòng)相的選擇

2.3.1 草酸濃度及pH的選擇

綜合國(guó)內(nèi)外研究進(jìn)展發(fā)現(xiàn)，流動(dòng)相中草酸的濃度和pH對(duì)于四環(huán)素的檢測(cè)和分析至關(guān)重要，因此，本實(shí)驗(yàn)中針對(duì)此因素進(jìn)行了比較研究。

四環(huán)素類藥物結(jié)構(gòu)中活性基團(tuán)較多,主要以陽(yáng)離子形式存在，流動(dòng)相中加入草酸可以與四環(huán)素類藥物形成離子對(duì)，從而降低了對(duì)色譜柱硅醇基的吸附，避免拖尾現(xiàn)象。本實(shí)驗(yàn)選擇用純水和濃度分別為0.01、0.02、0.03、0.05 mol/L的草酸進(jìn)行了測(cè)試，發(fā)現(xiàn)流動(dòng)相中不使用草酸時(shí)，色譜峰嚴(yán)重拖尾，加入草酸后分離度增加，峰形變尖。不同的草酸濃度對(duì)分離效果影響不大，因此，本實(shí)驗(yàn)選擇草酸的濃度為0.01 mol/L。

草酸溶液的pH對(duì)組分的分離效果也有一定的影響。本實(shí)驗(yàn)分別用pH為2.0、3.0和4.0的0.01 mol/L草酸溶液作為流動(dòng)相進(jìn)行了測(cè)定，發(fā)現(xiàn)三種條件下，三種四環(huán)素均能分開(kāi)，但隨pH的降低，各峰間的分離度增大，峰形尖銳，對(duì)稱性好。如果pH過(guò)低（pH＜2.0），四環(huán)素會(huì)發(fā)生降解，同時(shí)也不利于色譜柱的保護(hù)。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇草酸的pH為2.0。

2.3.2 色譜條件的選擇

實(shí)驗(yàn)分別采用不同的流動(dòng)相組成進(jìn)行了分離效果的對(duì)比。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，采用甲醇-乙腈-0.01 mol/L草酸（1.5+1.5+2.0，pH=2）作為流動(dòng)相進(jìn)行分析時(shí)，出峰時(shí)間短，三種四環(huán)素保留時(shí)間相似，無(wú)法分離；采用乙腈-0.01 mol/L磷酸二氫鈉（pH2.5）作為流動(dòng)相，四環(huán)素和土霉素?zé)o法分離；選用0.01 mol/L草酸-乙腈-甲醇進(jìn)行三元梯度洗脫，三種四環(huán)素得到較好的分離，因此本實(shí)驗(yàn)選擇三元梯度洗脫。下圖2為該色譜條件下，三種四環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)色譜圖和樣品添加色譜圖。

圖2 3種四環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)色譜圖和樣品添加色譜圖Fig.2 Standard spectrum and added sample spectrum of 3 tetracyclines

從圖2可以看到，奶樣中的三種四環(huán)素類藥物均能達(dá)到基線分離，分離效果較好。出峰順序依次為土霉素、四環(huán)素、金霉素。以x代表濃度（mg/L），y代表峰面積，測(cè)定三種四環(huán)素的標(biāo)準(zhǔn)曲線，以3倍信噪比求出檢出限。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 3種四環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸分析Table 1 Regression analysis for standard line of 3 tetracyclines

由表1可以看出三種四環(huán)素類藥物的標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)性較好，最低檢出限均能達(dá)到國(guó)標(biāo)的獸藥殘留最低限量要求。

2.3.3 加標(biāo)回收率測(cè)定

分別吸取5 mL空白奶樣于離心管中，各加入不同濃度的相應(yīng)抗生素混樣，加標(biāo)后用渦淪振蕩器振蕩5 min混合均勻，在冰箱中放置12 h后提取，使藥物均勻擴(kuò)散到奶中。每個(gè)濃度重復(fù)3次。結(jié)果見(jiàn)表2。

上述結(jié)果顯示，應(yīng)用本方法能夠有效檢測(cè)到奶制品中的土霉素、四環(huán)素和金霉素等抗生素殘留，方法的加標(biāo)回收率103%～109%之間，變異系數(shù)在4.46%～8.55%之間。

表2 奶中三種四環(huán)素的加標(biāo)回收率（n=3）Table 2 Recoveries of 3 tetracyclines in milk(n=3)

2.3.4 C18固相萃取柱反復(fù)使用效果的比較

取三種濃度為0.20 mg/L的四環(huán)素MCI-Vaine-Na2EDTA緩沖液5 mL，加入到活化后的C18固相萃取柱中，按樣品處理方法進(jìn)行富集、洗脫后，進(jìn)行HPLC分析。C18固相萃取柱反復(fù)使用五次，通過(guò)其回收率，確定其反復(fù)使用的可行性。結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 C18固相萃取柱反復(fù)使用效果的比較Table 3 Comperison of reuse effectiveness of C18solid extraction column

結(jié)果說(shuō)明，本方法中用于純化樣品的C18固相萃取柱可以多次反復(fù)使用，這樣的操作有助于降低該方法的分析成本。

同時(shí)，在檢測(cè)中發(fā)現(xiàn)，四環(huán)素類抗生素在pH＝4的MCI緩沖液中不穩(wěn)定，在室溫下8 h大約損失3%，因此提取物在分析前應(yīng)保存在4℃冰箱中以降低損失；提取物在-20℃可穩(wěn)定2 d。由于四環(huán)素類對(duì)光敏感，因此在整個(gè)操作過(guò)程中盡量避免日光直射。

3 結(jié)論

采用固相萃取純化，應(yīng)用梯度洗脫，建立了一種同時(shí)檢測(cè)牛奶中3種四環(huán)素類藥物殘留的HPLC方法。通過(guò)流動(dòng)相構(gòu)成比較、線性關(guān)系、最低檢出限以及空白樣品加標(biāo)回收率比較，證明該方法簡(jiǎn)便可行、結(jié)果可靠，可用于對(duì)牛奶中四環(huán)素類藥物殘留的檢測(cè)。

同時(shí)通過(guò)多次反復(fù)實(shí)驗(yàn)，證明本方法用于純化樣品的C18固相萃取柱可以多次反復(fù)使用，這有助于降低本方法的分析成本，利于方法的推廣和應(yīng)用。

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