裴華，牛莉娜，林英姿，王華民，王永霞，鄔強，夏乾峰

（海南醫(yī)學院熱帶醫(yī)學與檢驗醫(yī)學院，海南 ?？?571101）

紅樹林位于海洋和陸地之間的潮間帶，該區(qū)域土壤具有沼澤化、鹽漬化、強酸性和有機質(zhì)含量高等特點。生長于此的真菌等微生物種類豐富，目前已分離鑒定的紅樹林真菌超過200余種，已成為海洋真菌的第二大類群。相對與陸生真菌，生長于紅樹林特殊環(huán)境的真菌可能存在特殊的分子適應(yīng)機制，其代謝產(chǎn)物的表達水平與類型皆有可能獨特新穎[1]。

本研究以海南東寨紅樹林自然保護區(qū)作為土壤采樣地點,研究該環(huán)境中真菌發(fā)酵上清中活性產(chǎn)物的免疫調(diào)節(jié)活性。最終課題組獲得了一株產(chǎn)免疫調(diào)節(jié)活性胞外多糖的真菌菌株，初步鑒定為淡紫色擬青霉。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 樣本來源

土壤樣本采集于海南東寨紅樹林自然保護區(qū)，距

地表5 cm～20 cm采樣。采集后放入無菌塑料封口袋內(nèi)，迅速運回實驗室進行樣本處理。

1.1.2 人外周血單個核細胞

外周血采集自健康成年男性，無菌條件下聚蔗糖泛影葡胺密度梯度離心法分離獲得人外周血單個核細胞[2]。

1.1.3 昆明種小鼠

昆明種小鼠購買自廣州省醫(yī)學實驗動物中心；綿羊紅細胞、雞紅細胞均獲取自海南省藥物安全性評價中心。

1.1.4 其他主要試劑

發(fā)酵培養(yǎng)基采用大豆粉玉米粉培養(yǎng)基（大豆粉10.0g，玉米粉 10.0 g，可溶性淀粉 5.0 g，KH2PO40.5 g，50%陳海水定容至1 L，調(diào)pH 7.2）。查氏培養(yǎng)基、分離培養(yǎng)基采用陳海水馬丁培養(yǎng)基（50%陳海水配置、0.1%氯霉素）：購買自北京陸橋技術(shù)有限責任公司。香菇多糖購買自南京康海藥業(yè)有限公司：國藥準字H10950078。ConA購自Sigma公司，RPMI1640培養(yǎng)液：購自GIBCO公司。新生牛血清：購自杭州四季青工程材料有限公司。其余試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 真菌菌株的分離純化

稱取10 g土壤樣本，在無菌操作下加入100 mL無菌陳海水的三角瓶中，充分振蕩混勻后，進行10倍稀釋，取樣本上清制備成10-2至10-4不同稀釋度，各稀釋度取100μL涂布于分離培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)，對平板上不同形態(tài)菌落進行編號并觀察記錄[3]。

1.2.2 EPS的獲取

挑取單菌落接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵5d（250r/min，28℃），發(fā)酵液離心后（3000 r/min，4℃，20 min）取上清。發(fā)酵上清4℃10000 r/min離心20 min后，上清液以3倍體積冰乙醇4℃沉淀。24 h后4℃條件下4520 g離心15 min后，沉淀溶于去離子水中。鏈蛋白酶+Sevag法聯(lián)合脫蛋白[4]后，-50℃條件下凍干48 h后備用。

1.2.3 人外周血單個核細胞增殖刺激實驗（MTT法）

無菌條件下分離獲得人外周血單個核細胞，96孔細胞培養(yǎng)板內(nèi)每孔中加入人外周血單個核細胞1×105個。在待測樣本孔中加入含5 mg/mL EPS的RPMI1640培養(yǎng)液100μL，陽性對照孔內(nèi)加入含5mg/ml刀豆蛋白 A（ConA）RPMI1640 培養(yǎng)液 100μL，正常對照孔內(nèi)加入RPMI1640培養(yǎng)液100μL，各組培養(yǎng)液中新生牛血清含量均為10%，每個樣本3個復(fù)孔。37℃，5%CO2培養(yǎng)72 h后，加入含5 mg/mL MTT基礎(chǔ)培養(yǎng)液20μL，37℃，5%CO2培養(yǎng)。4 h后棄培養(yǎng)上清，每孔中加入100μL二甲亞砜，振蕩器振搖10 min，酶聯(lián)免疫檢測儀492 nm波長進行測定，630 nm參比波長，實驗重復(fù)3 次[5]。

1.2.4 動物免疫實驗

應(yīng)用上述方法從菌株發(fā)酵液中獲得大量胞外多糖凍干粉末后，以昆明種小鼠進行動物體內(nèi)實驗，評價活性產(chǎn)物對動物免疫功能影響情況[6]。實驗動物為昆明種小鼠，雌雄隨機，8～10 周齡，體重（20±3.0）g。隨機將小鼠分為3組，每組20只，實驗組以生理鹽水溶解胞外多糖凍干粉末（50 mg/kg）灌胃，陽性對照組以生理鹽水溶解香菇多糖（50 mg/kg）灌胃，正常對照組灌胃生理鹽水，灌胃體積1 mL，1次/d，連續(xù)28 d。

1.2.4.1 臟體指數(shù)測定

末次給藥后，禁食不禁水12 h，分別稱重。脫頸椎處死后剝離脾臟、胸腺稱重并計算脾臟/體重和胸腺/體重比值。

1.2.4.2 遲發(fā)型過敏反應(yīng)測定

末次給藥后，動物致敏前腹部脫毛，以1%二硝基氟苯（DNFB）5μL涂于小鼠腹部脫毛處，連續(xù)致敏4 d后右耳雙面涂以DNFB 10μL，24 h后處死小鼠，打孔器摘取左、右耳片各8 mm，稱重。

1.2.4.3 血清溶血素抗體生成測定（HC50）

小鼠于首次給藥后23 d，每只腹腔注射0.2 mL 4%（體積分數(shù)）的綿羊紅細胞致敏。于末次給藥后12 h，摘眼球收集血液。分離血清，按體積比1∶200生理鹽水稀釋。測定小鼠血清溶血素含量，計算半數(shù)溶血值（HC50）。

1.2.4.4 巨噬細胞吞噬功能測定

末次給藥后于小鼠腹腔注射2%溶解淀粉溶液1 mL，次日腹腔注射5%雞紅細胞0.5 mL，40 min后處死小鼠，取腹腔液涂片，瑞氏-姬姆薩染色，油鏡下計數(shù)100個MФ中已吞噬雞紅細胞的MФ數(shù)及未吞噬數(shù)。

1.2.5 菌株分類鑒定

對菌株P(guān)H0016進行形態(tài)學鑒定；同時對菌株ITS序列進行分析，進行系統(tǒng)發(fā)育分析[7]。

2 結(jié)果

2.1 菌株分離、篩選、刺激人外周血單個核細胞增殖活性檢測結(jié)果

從東寨紅樹林自然保護區(qū)土壤樣本中共分離得到真菌536株，其中菌株P(guān)H0016的EPS促進人外周血單個核細胞增殖較為突出和穩(wěn)定，被應(yīng)用于后續(xù)研究，實驗結(jié)果見表1。相比于正常對照，菌株P(guān)H0016所產(chǎn)生的EPS在體外對于人外周血單個核細胞具有較顯著的刺激增殖作用（P<0.05）。

表1 菌株P(guān)H0016EPS對單個核細胞增殖的影響()Table1 Effect of EPS from strain PH0016 on proliferation of PBMC

表1 菌株P(guān)H0016EPS對單個核細胞增殖的影響()Table1 Effect of EPS from strain PH0016 on proliferation of PBMC

注：*與正常對照組比較，P<0.05。

2.2 臟體指數(shù)

根據(jù)表2所示實驗結(jié)果表明，菌株P(guān)H0016所產(chǎn)生的EPS小鼠灌胃28 d后，相比于正常對照，小鼠的脾臟/體重、胸腺/體重的臟體指數(shù)有顯著性提高（P<0.05）。

2.3 遲發(fā)型過敏反應(yīng)

根據(jù)表2所示實驗結(jié)果提示，菌株P(guān)H0016所產(chǎn)生的EPS可顯著促進昆明種小鼠機體對DNFB致敏的反應(yīng)性，相比于正常對照，經(jīng)DNFB致敏后耳片重量明顯增加（P＜0.05）。

表2 菌株P(guān)H0016胞外多糖對小鼠臟體指數(shù)及遲發(fā)型超敏反應(yīng)的影響()Table 2 Effect of EPS from strain PH0016 on ratio of organs to body and DTH

表2 菌株P(guān)H0016胞外多糖對小鼠臟體指數(shù)及遲發(fā)型超敏反應(yīng)的影響()Table 2 Effect of EPS from strain PH0016 on ratio of organs to body and DTH

注：*與正常對照組比較，P<0.05。

2.4 血清溶血素生成測定（HC50）

經(jīng)菌株P(guān)H0016胞外多糖連續(xù)灌胃后，相比正常對照HC5021.54±3.27，實驗組HC50有顯著提高達到124.36±32.56（P<0.01）。小鼠體內(nèi)針對綿羊紅細胞刺激產(chǎn)生的溶血素水平顯著提升，實驗結(jié)果見表3。

表3 EPS對小鼠HC50及吞噬細胞吞噬功能的影響()Table 3 Effect of EPS from strain PH0016 on HC50and phagocytic function

表3 EPS對小鼠HC50及吞噬細胞吞噬功能的影響()Table 3 Effect of EPS from strain PH0016 on HC50and phagocytic function

注：*與正常對照組比較，P<0.01。

2.5 小鼠腹腔巨噬細胞吞噬功能

菌株P(guān)H0016胞外多糖連續(xù)灌胃后，實驗組小鼠腹腔吞噬細胞吞噬雞紅細胞的吞噬效率達到（52.38±4.28）%，吞噬指數(shù)為1.56±0.17，相比于正常對照的吞噬效率18.76±5.10和吞噬指數(shù)0.50±0.19有顯著升高（P<0.01），實驗結(jié)果見表 3。

2.6 菌株P(guān)H0016分類鑒定

2.6.1 菌株P(guān)H0016的形態(tài)學特征

接種于查氏培養(yǎng)基上培養(yǎng)3 d見菌落生長，7 d直徑可達15 mm～18 mm。菌落扁平、質(zhì)地疏松、粉絮狀、淡紫色。表面紫色為產(chǎn)孢層，產(chǎn)孢旺盛，肉眼可見紫色孢子密集。菌落邊緣質(zhì)地疏松，呈白色，菌落背面呈白色。PDA培養(yǎng)基形態(tài)同查氏培養(yǎng)基。沙氏培養(yǎng)基上菌落生長速度緩慢，灰白色，中央隆起，質(zhì)地較疏松，不形成紫色色素。光鏡下營養(yǎng)菌絲壁光滑，無色透明。分生孢子梗光滑無色，單個小梗直立于營養(yǎng)菌絲上，瓶?；颗虼螅吖Ｉ嫌?～4個瓶梗狀的輪生分枝。頂部錐形變細，形成較薄獨特的頸，分生孢子成向兩側(cè)分開的鏈狀，偶有糾纏，分生孢子呈卵形或近球形，成熟后表面粗糙，透明無色，成團時呈紫色。

2.6.2 ITS序列分析結(jié)果

測序獲得菌株P(guān)H0016ITS序列長度為588 bp。將該序列與Genbank相關(guān)序列進行BLAST相似性分析，選取與其同源性較高菌株，用Neighbour Joining method構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖1）。結(jié)果顯示，PH0016與一株未明確命名的真菌菌株（FJ612890，F(xiàn)ungal sp.ARIZ L99）聚為一支，兩者相似率達到100%，其Bootsrap支持率為100%；其分類地位為子囊菌綱（Ascomycetes）；肉座菌目（Hypocreales）；麥角菌科（Clavicipitaceae）；擬青霉屬（Paecilomyces）。

圖1 基于ITS序列的菌株P(guān)H0016與相關(guān)菌株系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 Dendrogram of rDNA ITS sequence of PH0016

3 討論

課題組在海南東寨紅樹林自然保護區(qū)土壤樣本中分離得到真菌536株，其中菌株P(guān)H0016經(jīng)初步形態(tài)學和系統(tǒng)發(fā)育鑒定為淡紫色擬青霉菌株。該菌株所產(chǎn)生的胞外多糖在體外具有較好的刺激人外周血單個核細胞增殖效應(yīng)。小鼠體內(nèi)實驗發(fā)現(xiàn)，該菌株所產(chǎn)生的胞外多糖連續(xù)灌胃小鼠后，對于小鼠臟體指數(shù)、血清溶血素生成水平、遲發(fā)型過敏反應(yīng)應(yīng)答能力及小鼠腹腔巨噬細胞吞噬功能均有較為顯著的增強效應(yīng)。這些指標的提升說明，淡紫色擬青霉菌株P(guān)H0016所產(chǎn)生的胞外多糖對小鼠特異性和非特異性免疫應(yīng)答均有一定的增強效果。綜合上述分析，課題組從海南近海紅樹林地區(qū)分離獲得一株產(chǎn)免疫增強效應(yīng)胞外多糖的淡紫色擬青霉菌株。

糖單體之間有多種不同的連接方式，可形成不同構(gòu)型的直鏈和支鏈結(jié)構(gòu)。通過單糖分子間氫鍵及基團的相互作用進一步又可進一步形成不同的高級結(jié)構(gòu)，3個單糖最多可以有27648種可能的排列方式，寡糖鏈多變的連接方式和分支結(jié)構(gòu)使多糖承載了巨大的生物信息[8-9]。

課題組從海南紅樹林分離獲得一株淡紫色擬青霉，初步證實其胞外多糖具有免疫調(diào)節(jié)活性，這可能與真菌為適應(yīng)特殊生存環(huán)境而產(chǎn)生獨特代謝機制和新穎代謝產(chǎn)物有關(guān)。

本研究獲得真菌菌株存在于海南紅樹林底泥之中，對近海環(huán)境有較好的適應(yīng)性。對該菌株生物學性狀及代謝途徑的進一步研究，以及對菌株所產(chǎn)生EPS的組份與結(jié)構(gòu)的進一步分析，將可能為當?shù)啬壳叭找鏀U大的近海水產(chǎn)養(yǎng)殖及保健食品開發(fā)提供理論研究參考。

[1]CHENG Zhong-shan,PAN Jia-Hui,TANG Wen-cheng,et al.Biodiversity and biotechnological potential of mangrove-associated fungi[J].Forestry research,2009,20(1):63-72

[2]柳忠輝,呂昌龍.免疫學常用實驗技術(shù)[M].北京:科學出版社,2007:73-76

[3]繆承杜,莊令,林海鵬,等.海南文昌清瀾港紅樹林真菌抗B16腫瘤細胞活性菌株的篩選[J].生物工程學報,2008,24(6):975-979

[4]S?wén E,Huttunen E,Zhang X,et al.Structural analysis of the exopolysaccharide produced by Streptococcus thermophilus ST1 solely by NMR spectroscopy[J].Biomol NMR,2010,47(2):125-134

[5]王新國,劉杞,孫航,等.人肝再生增強因子對人外周血單個核細胞增殖的影響及其機制[J].中國生物制品學雜志,2009,22(10):961-963

[6]黃雨三.保健食品檢驗與評價技術(shù)規(guī)范實施手冊[M].北京:清華同方電子出版社,2003:369-372

[7]牛莉娜,王英,饒朗毓,等.一株具有免疫增強活性的海南紅樹林真菌WC1016的分類鑒定[J].海南醫(yī)學院學報,2011,17(8):1009-1014

[8]戴慧,高曉明.多糖特異性免疫識別的分子機制及其免疫生物學意義[J].中國免疫學雜志,2009,25(1):35-39

[9]Arthur O Tzianabos.Polysaccharide immunomodulators as therapeutic agents:structural aspects and biologic function[J].Clinical microbiology reviews,2000,13(4):523-533