王 瓊 張利仙 李維薇 李 冰 艾 軍 周曉黎

（1.中國科學(xué)院昆明動(dòng)物研究所，昆明 650223；2.大理洱海湖泊研究中心，大理 671000；3.云南出入境檢驗(yàn)檢疫局，昆明 650228）

非人靈長類動(dòng)物由于其與人類相似的生物和行為特征，成為解決人類健康和疾病問題的理想動(dòng)物模型[]。隨著國際市場對(duì)實(shí)驗(yàn)猴需求量的增加，對(duì)實(shí)驗(yàn)猴也提出了嚴(yán)格的要求，實(shí)驗(yàn)猴從普通級(jí)別向SPF（無特定病原體）猴發(fā)展[]。1992年，中華人民共和國衛(wèi)生部頒布的《醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物標(biāo)準(zhǔn)》規(guī)定，STLV-1型是SPF實(shí)驗(yàn)猴必須排除的病毒之一。自從1982年首次在非人靈長類動(dòng)物發(fā)現(xiàn)存在自然發(fā)生的HTLV相關(guān)病毒之后，從世界各地的非人類靈長類動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)許多猿猴T細(xì)胞淋巴細(xì)胞白血病病毒（STLV）的不同譜系（STLV-l、STLV-2、STLV-3）[1-2]。猴嗜T淋巴白血病病毒（Simian T-lymphotropic virus，STLV），它與人T淋巴白血病病毒（Human T-lymphotropic virus，HTLV）統(tǒng)稱為靈長類嗜T淋巴細(xì)胞病毒（Primate T-lymphotropic virus，PTLV），屬于RNA腫瘤病毒亞科，δ逆轉(zhuǎn)錄病毒屬[3]。STLV 與惡性淋巴瘤、淋巴組織增生等疾病具有相關(guān)性，但大多數(shù)情況下，感染了STLV的獼猴僅僅作為病毒攜帶者而在相當(dāng)長一段時(shí)期內(nèi)表現(xiàn)為無癥狀狀態(tài)。大量的文獻(xiàn)報(bào)道，STLV不僅可以在非人靈長類間傳播，還可以傳播給人類。

中國是世界上靈長類資源豐富的國家之一，隨著國際市場對(duì)靈長類資源的需求量的增大，同時(shí)對(duì)出口的靈長類動(dòng)物提出嚴(yán)格的檢疫要求。STLV病毒的存在不僅影響實(shí)驗(yàn)猴的質(zhì)量，而且對(duì)飼養(yǎng)人員和實(shí)驗(yàn)人員的健康也存在很大的隱患。目前，對(duì)STLV病毒的檢測方法主要有病原分離、PCR、熒光免疫及ELISA方法。在進(jìn)出口貿(mào)易的檢疫中，一般采用的是血清學(xué)檢測法，一種方法是采用細(xì)胞系對(duì)分離到的病毒進(jìn)行培養(yǎng)，然后收集其分泌液作為抗原來檢測猴群中血清STLV抗體的含量，這種方法不但成本較高而且對(duì)工作人員的安全有較高的威脅；另一種方法是使用商品化的試劑盒來檢測STLV病毒，現(xiàn)在市場上使用較多的是用HTLV的相應(yīng)抗原作為診斷抗原，這種方法特異性不夠高[4]。因此建立一種方便、快捷、靈敏度高、特異性強(qiáng)、經(jīng)濟(jì)節(jié)約的檢測方法是必要的。

本實(shí)驗(yàn)通過人工合成STLV病毒保守基因gag，構(gòu)建昆蟲桿狀病毒表達(dá)載體，并轉(zhuǎn)染sf9細(xì)胞，成功表達(dá)出猴STLV病毒gag蛋白，為以基因工程抗原為基礎(chǔ)的猴STLV病毒ELISA檢測方法的建立奠定了基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 質(zhì)粒和菌種

Pbluescriptsk-gag（攜帶人工合成的猴嗜T淋巴白血病病毒STLV gag 基因）其gag基因參照序列g(shù)enbank（登錄號(hào)：AY590142），由上海生工合成。pFastBacHTB質(zhì)粒、ECoil.Top10和DH10Bac菌株，為云南出入境檢驗(yàn)檢疫局動(dòng)檢實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 主要的試劑和儀器

質(zhì)粒小量提取試劑盒、凝膠回收試劑盒購于AxyGEN公司，限制性內(nèi)切酶BamHI和HindIII、DNA Marker、T4連接酶購于TaKaRa公司；Cellfectin轉(zhuǎn)染試劑盒購自invitrogen公司；胎牛血清、Grace，s 細(xì)胞培養(yǎng)基購自GBICO公司；抗HIS單抗購自天根生化科技有限公司，山羊抗小鼠IgG/辣根酶（HRP標(biāo)記）購自Southern Biotech公司；PCR儀是eppondoff。其他試劑及儀器均為商業(yè)公司購買。

1.3 引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)S T L V g a g基因堿基序列設(shè)計(jì)了兩對(duì)引物，其中，S015-CGGCGAGAATACCAGCAACT-3，S02：5-TTCCAGTGGGTTGGGTCTTG-3，跨幅452bp，用于gag的鑒定；S1：5-TTTGGATCCATGAAATTCTTAGTCAACGTT -3，S2 5-CCCAAGCTTTTAAGCCTCCCCCCCT -3，下劃線部分分別為BimHI和HindIII酶切位點(diǎn)，跨幅1395bp用于擴(kuò)增STLV gag基因；通用引物（M13）序列參照Bac-to-Bac桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)使用手冊，以上引物均由invitrogen公司合成。

1.4 pFastBacHTB-gag重組質(zhì)粒的構(gòu)建

用引物S1和S2，以Pbluescriptsk-gag質(zhì)粒為模板，通過PCR擴(kuò)增得到gag基因片段。通過BamHI和HindIII酶雙酶切，與用相同的酶切處理的昆蟲表達(dá)載體pFastBacHTB連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化TOP10感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)過慶大霉素和氨芐青霉素培養(yǎng)基篩選，提取質(zhì)粒，通過對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行PCR擴(kuò)增、酶切和測序鑒定，表明獲得了重組質(zhì)粒pFastBacHTB-gag。

1.5 重組質(zhì)粒 pFastBacHTB-gag的轉(zhuǎn)座

將陽性質(zhì)粒 pFastBacHTB-gag轉(zhuǎn)化含有桿狀病毒穿梭載體的DH10Bac感受態(tài)細(xì)胞，構(gòu)建桿狀病毒表達(dá)載體，通過卡那霉素、四環(huán)素和慶大霉素篩選重組轉(zhuǎn)座子Bacmid-gag，提取桿粒，分別用M13引物和引物S01/S02進(jìn)行PCR鑒定。

1.6 重組桿粒在昆蟲細(xì)胞中的表達(dá)及重組蛋白的鑒定

提取轉(zhuǎn)座桿粒Bacmid-gag，按Cellfection轉(zhuǎn)染試劑說明書轉(zhuǎn)染sf9昆蟲細(xì)胞，在28℃培養(yǎng)96h后，反復(fù)凍融細(xì)胞，收集上清液并盲傳3代，將反復(fù)凍融細(xì)胞后得到的上清液進(jìn)行SDS-PAGE及Western blot鑒定。

2 結(jié)果

2.1 重組質(zhì)粒pFastBacHTB-gag的鑒定

重組質(zhì)粒pFastBacHTB-gag 經(jīng) BamHI和HindIII酶切處理后，回收gag基因片段，與經(jīng)過相同酶切處理的pFastBacHTB載體相連，轉(zhuǎn)化TOP10感受態(tài)細(xì)胞，得到重組質(zhì)粒pFastBacHTB-gag。該質(zhì)粒用引物S01/S02對(duì)其進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物為452bp（見圖1泳道2），與理論值相符。同時(shí)經(jīng)BamHI和HindIII雙酶切，酶切產(chǎn)物分別為1395bp和4766bp（見圖1泳道1），均與理論值相符。

圖1 pFastBacHTB-gag雙酶切及PCR鑒定

2.2 轉(zhuǎn)座桿粒的PCR鑒定

pFastBacHTB-gag轉(zhuǎn)化DH10Bac感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)慶大霉素、卡那霉素、四環(huán)素篩選后，提取其重組桿粒Bacmid-gag，分別用M13引物和S01/S02引物對(duì)其進(jìn)行PCR鑒定，擴(kuò)增產(chǎn)物分別為3825bp（見圖2泳道1和2）和452 bp（見圖2泳道3），表明獲得了轉(zhuǎn)座的桿粒。

圖2 重組桿粒Bacmid-gag的PCR鑒定結(jié)果

2.3 重組蛋白gag的鑒定

重組桿粒Bacmid-gag轉(zhuǎn)染sf9 昆蟲細(xì)胞96 h后，取其上清液感染昆蟲細(xì)胞，并盲傳3代后，將反復(fù)凍融細(xì)胞后得到的上清液進(jìn)行SDS-PAGE及Western blot鑒定，結(jié)果如圖3（條帶1和2）、4所示，結(jié)果表明成功的獲得重組gag蛋白。

圖3 gag 重組蛋白的SDS-PAGE 鑒定

圖4 gag 重組蛋白的western blot鑒定

3 討論

本研究提出一種能在昆蟲細(xì)胞中成功表達(dá)STLV病毒gag基因的方法，這一方法的優(yōu)勢在于三點(diǎn)：一是人工合成STLV病毒保守基因gag，避免直接接觸活病毒的培養(yǎng)；二是表達(dá)載體pfastbacHTB上的6xHis 標(biāo)記，組氨酸標(biāo)簽的優(yōu)點(diǎn)在于它在非變性（能保持蛋白質(zhì)的構(gòu)象和功能）和變性（包涵體形式的蛋白質(zhì)）條件下都能有效地工作，因此表達(dá)載體上的6xHis 標(biāo)記為表達(dá)出的蛋白的純化提供了方便。三是昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)具有原核細(xì)胞無法比擬的優(yōu)點(diǎn)：表達(dá)量高且對(duì)蛋白的后加工系統(tǒng)與哺乳動(dòng)物細(xì)胞接近，能識(shí)別與切除信號(hào)肽，能對(duì)表達(dá)的蛋白進(jìn)行切割、磷酸化、糖基化等修飾，表達(dá)的外源蛋白接近天然蛋白，具有很高的生物學(xué)活性。

國內(nèi)學(xué)者盧愛桃等人用原核表達(dá)系統(tǒng)成功表達(dá)出了STLV病毒gag重組蛋白，以表達(dá)抗原建立其ELISA檢測方法，結(jié)果表明所建立的方法檢測自然感染的籠養(yǎng)恒河猴血清中STLV-1抗體取得了良好的效果。

本實(shí)驗(yàn)正是基于盧愛桃等人的研究結(jié)果，結(jié)合昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)良特點(diǎn)，通過構(gòu)建昆蟲細(xì)胞表達(dá)載體，成功地在昆蟲細(xì)胞中表達(dá)出猴STLV病毒gag蛋白，為建立基因工程抗原為基礎(chǔ)的猴STLV病毒ELISA檢測方法奠定基礎(chǔ)。

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