宋京城，金小花，蔡健

（蘇州農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院食品系，江蘇 蘇州 215008）

碳源對(duì)β-葡萄糖苷酶合成的影響研究

宋京城，金小花，蔡健

（蘇州農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院食品系，江蘇 蘇州 215008）

以黑曲霉（AspergiLLus niger NL－1）為產(chǎn)酶菌種，采用搖瓶發(fā)酵法，研究不同碳源對(duì)β－葡萄糖苷酶合成的影響。以水楊素為底物，以單位時(shí)間內(nèi)催化水解水楊素產(chǎn)生葡萄糖的量表示酶活單位，測(cè)定酶活力。結(jié)果表明，麩皮為最佳的碳源，適宜的使用量為4%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）。以純淀粉、微晶纖維素、葡萄糖、蔗糖、纖維二糖等為碳源酶活力很低，或不產(chǎn)酶。以麩皮為底物的最佳產(chǎn)酶時(shí)間為5 d，β-葡萄糖苷酶活力達(dá)到98.02 nkat/mL。纖維二糖對(duì)麩皮為碳源產(chǎn)β-葡萄糖苷酶無誘導(dǎo)作用。

β-葡萄糖苷酶；碳源；黑曲霉NL-1

纖維素酶酶系的3個(gè)組分分別為內(nèi)切-β-1，4-葡聚糖酶（Endoglucanase，EC 3.2.1.4），即C1酶；外切－β－1，4－葡聚糖酶（Cellobiohydrolase，EC 3.2.1.91），即Cx酶；β－葡萄糖苷酶（β－Glueosidase，EC3.2.1.21）。3種組分協(xié)同作用能催化水解芳基或烴基與糖基原子團(tuán)之間的糖苷鍵生成葡萄糖。其中β-葡萄糖苷酶可以降解纖維素（如秸稈中）的纖維二糖生成葡萄糖，缺乏β-葡萄糖苷酶將導(dǎo)致酶水解得率下降，并嚴(yán)重影響C1和Cx酶的酶促反應(yīng)[1]。β-葡萄糖苷酶在飼料、酒精、紡織品和保健食品等領(lǐng)域具有巨大的市場(chǎng)潛力，是酶制劑工業(yè)中的一個(gè)新的增長(zhǎng)點(diǎn)。目前用于生產(chǎn)纖維素酶類的微生物大多屬于絲狀真菌，研究較多的有木霉屬、曲霉屬、根霉屬和漆斑霉屬，其中曲霉是公認(rèn)產(chǎn)纖維素酶類最高的菌種之一[2-4]。本實(shí)驗(yàn)以不同碳源為培養(yǎng)基，對(duì)黑曲霉NL-1產(chǎn)生β-葡萄糖苷酶進(jìn)行研究，為生產(chǎn)利用纖維素酶提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌種和主要試劑、儀器

黑曲霉NL-1：由南京林業(yè)大學(xué)生物工程系菌種保藏室提供。

水楊素0.1%：國(guó)藥集團(tuán)北京化學(xué)試劑公司；考馬斯亮藍(lán)G-250：上?？贫松锟萍加邢薰?；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純或其配制，722s型可見分光光度計(jì)、SHZ-C型搖床：上海機(jī)密科學(xué)儀器有限公司；電熱恒溫水浴鍋：DK-98-1型，天津泰斯特儀器有限公司。

1.1.2 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基：馬鈴薯蔗糖瓊脂培養(yǎng)基，供保存和活化菌種用。

產(chǎn)酶發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基：（NH4）2SO40.4%，KH2PO40.3%，CaCl20.05%，MgSO40.05%，F(xiàn)eSO40.005%，ZnCl20.00014%，吐溫-802滴，pH4.8，分裝于容積為250 mL的三角瓶中（每瓶100 mL），121℃滅菌30 min。在此培養(yǎng)基中分別加入不同碳源時(shí)則為實(shí)驗(yàn)用的不同碳源的“發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基”。

1.2 方法

1.2.1 菌種制作

以無菌操作將供試菌種移入斜面培養(yǎng)基中，置28℃恒溫培養(yǎng)，待斜面長(zhǎng)滿孢子后用無菌水制成含量為4×106個(gè)/mL孢子懸液。

1.2.2 搖瓶發(fā)酵

將制備好的孢子懸液接種于制備好的“產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基”中，接種量為2%（體積分?jǐn)?shù)）。置（35±1）℃恒溫振蕩發(fā)酵，轉(zhuǎn)速150 r/min。

1.2.3 β-葡萄糖苷酶活力測(cè)定

以水楊素為底物，定義在最適反應(yīng)條件下每分鐘催化水解水楊素產(chǎn)生1μmol葡萄糖的酶量為1個(gè)酶活單位（U）。1 U=16.67×10-9kat=16.67 nkat。

空白管中加1.5 mL 1 mol/L檸檬酸緩沖液，0.5 mL 1%水楊素。其他樣品管中加1.3 mL 1 mol/L檸檬酸緩沖液，0.5 mL 1%水楊素，0.2 mL酶液。在60℃水浴保溫30 min。取出，加5 mL DNS（3，5-二硝基水楊酸溶液），煮沸5 min，定容至25 mL，用分光光度計(jì)在540 nm下進(jìn)行比色測(cè)定。

1.2.4 總還原糖濃度的測(cè)定

采用DNS（3，5－二硝基水楊酸溶液）法[5]。

1.2.5 可溶性蛋白質(zhì)的測(cè)定

采用改良的Bradford法測(cè)定[5]。

1.2.6 碳源的優(yōu)化試驗(yàn)

分別選用麩皮、純淀粉、微晶纖維素、葡萄糖、蔗糖、纖維二糖等6種物質(zhì)作為碳源，加入到“產(chǎn)酶發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基”中，添加量均分別為4%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)），制備成為“產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基”。按“1.2.2”接種發(fā)酵，分別在第2、3天取樣，測(cè)其pH、蛋白含量、還原糖以及β-葡萄糖苷酶酶活。

1.2.7 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)產(chǎn)酶的影響試驗(yàn)

“產(chǎn)酶發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基”中以5%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）麩皮作為碳源,按“1.2.2”接種發(fā)酵，分別于發(fā)酵的第2、3、4、5、6天取樣測(cè)其pH、蛋白質(zhì)含量、還原糖及β-葡萄糖苷酶酶活。

1.2.8 不同濃度碳源對(duì)產(chǎn)酶的影響試驗(yàn)

1.2.8.1 不同濃度的麩皮對(duì)產(chǎn)酶的影響

在“產(chǎn)酶發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基”中分別加入1%、2%、3%、4%、5%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）麩皮作為碳源進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)酶比較試驗(yàn)，按“1.2.2”接種發(fā)酵，分別在第2、3、4天取樣，測(cè)定其蛋白質(zhì)含量、還原糖量、酶活力。

1.2.8.2 不同濃度的淀粉對(duì)產(chǎn)酶的影響

在“產(chǎn)酶發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基”中分別加入1%、2%、3%、4%、5%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）純淀粉作為碳源進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)酶比較試驗(yàn),按“1.2.2”接種發(fā)酵，分別在第1、2、4天取樣，測(cè)定其有酶無底和有酶有底的C值。

1.2.8.3 纖維二糖對(duì)β-葡萄糖苷酶合成的影響

在“產(chǎn)酶發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基”中以4%的麩皮作為碳源，同時(shí)分別加入0%、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）的纖維二糖進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)酶比較試驗(yàn)，按“1.2.2”接種發(fā)酵，分別在第3、4天取樣，測(cè)定其pH、蛋白質(zhì)含量、酶活力。

2 結(jié)果與分析

2.1 碳源的優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果

碳源的優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果如表1、表2所示。

表 1 第2天幾種不同碳源的產(chǎn)酶效果Table 1 The effect of several different carbon sources 2nd days

表 2 第3天幾種不同碳源產(chǎn)酶效果Table 2 The effect of several different carbon sources 3th days

從表1、2可以看出，以麩皮作碳源時(shí)產(chǎn)酶的濾紙酶活最高，達(dá)到62.35 nkat/mL，而其他以純淀粉、微晶纖維素、葡萄糖、蔗糖、纖維二糖作為碳源的基本上不產(chǎn)酶或酶活很低。麩皮為碳源時(shí)還原糖的利用率較高，第2天為3.53 mg/mL，第3天則迅速下降到0.67 mg/mL。

在培養(yǎng)的第2天，由于菌絲體的快速繁殖使得麩皮培養(yǎng)基已經(jīng)變得很黏稠，并可見直徑約為1 mm左右的菌絲體小球；分別添加其它不同碳源的培養(yǎng)基也有同樣的現(xiàn)象：培養(yǎng)基的顏色均與接種前基本相同。培養(yǎng)至第3天時(shí)麩皮培養(yǎng)基更加黏稠，菌絲體小球已溶解不能見；微晶纖維素培養(yǎng)基的菌絲體球少且很小，培養(yǎng)基顏色變?yōu)辄S綠色；其他培養(yǎng)基中的菌絲體小球均變大達(dá)3 mm～4 mm。

2.2 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)產(chǎn)酶的影響試驗(yàn)結(jié)果

培養(yǎng)時(shí)間對(duì)產(chǎn)酶的影響試驗(yàn)結(jié)果如圖1所示。

由圖1可知，從培養(yǎng)的第2天開始酶活不斷增加，到第5天時(shí)達(dá)到最高值98.02 nkat/mL，第6天酶活出現(xiàn)下降。同時(shí)可以直觀地看出蛋白質(zhì)的消長(zhǎng)曲線和酶活曲線的走向大致相同；pH的變化隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加而緩慢減小，但在第5天后略有增加，這便成了第6天酶活下降的原因之一。

培養(yǎng)基中還原糖從第2天的3.57 mg/mL降到第3天的1.87 mg/mL，此階段消耗的碳源主要用于菌絲體的增殖；第3、4天是黑曲霉合成β-葡萄糖苷酶的主要階段，在這一階段，黑曲霉僅需少量葡萄糖滿足自身的新陳代謝，在產(chǎn)酶末期幾乎不再消耗葡萄糖[6]。

2.3 不同濃度碳源對(duì)產(chǎn)酶的影響試驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 不同濃度的麩皮對(duì)產(chǎn)酶的影響結(jié)果

不同濃度的麩皮對(duì)產(chǎn)酶的影響結(jié)果如圖2所示。

從圖2可看出，第4天，培養(yǎng)基中麩皮濃度為5%時(shí)，酶活最高達(dá)92.85 nkat/mL。但與麩皮濃度為4%的87.68 nkat/mL比較相差甚小。麩皮濃度為1%、2%、3%時(shí)第4天酶活仍都很低，最高值為47.68 nkat/mL，最小為5.67 nkat/mL，這說明碳源濃度過低對(duì)產(chǎn)酶非常不利[7]。

麩皮濃度為1%、2%、3%時(shí)培養(yǎng)基中還原糖濃度始終維持在較低的水平；而麩皮濃度為4%、5%時(shí)還原糖的濃度則相對(duì)較高，在第2天分別為3.59 mg/mL和4.86 mg/mL。

2.3.2 不同濃度的淀粉對(duì)產(chǎn)酶的影響結(jié)果

不同濃度的淀粉對(duì)產(chǎn)酶的影響結(jié)果如表3所示。

由表3中第1、2、4天的有酶無底和有酶有底的C值的比較可以看出，不同淀粉濃度下有酶無底和有酶有底的值非常接近，這表明純淀粉做碳源時(shí)，發(fā)酵結(jié)果并不產(chǎn)酶或者產(chǎn)酶量很少。從第1天到第4天pH下降非常劇烈，也許會(huì)導(dǎo)致所產(chǎn)酶失活[8]。所以純淀粉不適宜作本實(shí)驗(yàn)菌株產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的碳源。

2.3.3 纖維二糖對(duì)β-葡萄糖苷酶合成的影響結(jié)果

纖維二糖對(duì)β-葡萄糖苷酶合成的影響結(jié)果如表4所示。

表 3 淀粉濃度對(duì)產(chǎn)酶的影響Table 3 The comparison of different concentration starch on enzyme production

表 4 不同濃度纖維二糖對(duì)產(chǎn)酶的影響Table 4 The effect of different cellobiose concentration on the enzyme production

由表4中可知，第3天的酶活的變化均在93.52 nkat/mL左右，第4天的酶活的變化均在128.03 nkat/mL左右；可見有無纖維二糖及其添加量多少對(duì)酶活的大小并無影響，pH則隨著纖維二糖濃度的增加逐步下降，蛋白質(zhì)的變化不明顯。

3 結(jié)論

碳源的種類對(duì)被試黑曲霉菌株產(chǎn)酶酶活的高低有著非常重要的影響，以麩皮作碳源時(shí)酶活最高，而以純淀粉、微晶纖維素、葡萄糖、蔗糖、纖維二糖作為碳源時(shí)的基本上不產(chǎn)酶或酶活很低。以5%的麩皮作為碳源，第5天時(shí)酶活達(dá)到最高（98.02 nkat/mL）。麩皮濃度為5%和4%是產(chǎn)酶比較相差甚小，從經(jīng)濟(jì)效益上來講應(yīng)選用4%麩皮，碳源濃度過低不利于產(chǎn)酶。以麩皮作培養(yǎng)基加入不同濃度的纖維二糖作為誘導(dǎo)物，發(fā)現(xiàn)纖維二糖或者添加纖維二糖的多少對(duì)酶活的大小并無影響，而純的纖維二糖基本上不產(chǎn)酶。

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Study on Carbon Source of β-Glucosidase by AspergiLLus niger

SONG Jing-cheng， JIN Xiao-hua，CAI Jian
（Department of Food，Suzhou Polytechnic Institute of Agriculture，Suzhou 215008，Jiangsu，China）

Effects of carbon sources on the biosynthesis of β－Glucosidase by AspergiLLus niger NL－1.We investigated Salicin as the substrate was used to indicate activity in unit time.The results showed that bran was the best carbon source for β－Glucosidase production among the studied carbon sources，and it's preferable concentration was 4%.Starch，microcrystalline cellulose，glucose，sucrose，cellobiose，etc.were not carbon sources for β－Glucosidase production.The best time for fermentation is 5 days，in the case，the highest activity of β－Glucosidase 98.02 nkat was obtained.Cellobiose as bran carbonsource hadn't been inducing effect.

β－Glucosidase；carbonsource；Aspergillus niger NL－1

江蘇省高校自然科學(xué)研究計(jì)劃項(xiàng)目（05KJD150195）

宋京城（1980—），男（漢），講師，碩士，研究方向：食品與生物技術(shù)。

2011-08-13