張付云，李云冰，楊晴宇，李妍，王斌，楊陽，蒼桂璐

（大連海洋大學(xué)食品工程學(xué)院，遼寧 大連 116023）

用螠蟶貝殼制備乳酸菌富集鈣的工藝

張付云，李云冰，楊晴宇，李妍，王斌，楊陽，蒼桂璐

（大連海洋大學(xué)食品工程學(xué)院，遼寧 大連 116023）

為了充分利用螠蟶貝殼資源開發(fā)新型生態(tài)補(bǔ)鈣制劑，用兩種乳酸菌發(fā)酵螠蟶貝殼粉，以發(fā)酵結(jié)束后乳酸菌的活菌數(shù)和游離鈣轉(zhuǎn)化率為指標(biāo)，優(yōu)選出最佳發(fā)酵工藝。研究結(jié)果表明，最佳發(fā)酵條件為300目粒度的螠蟶貝殼粉15%，蔗糖8%，1:1混合的保加利亞桿菌和嗜熱鏈球菌接種量7%，發(fā)酵30 h。

螠蟶貝殼粉；保加利亞桿菌；嗜熱鏈球菌；離子鈣

人體是一個(gè)有機(jī)的生命體，在所有的生命活動過程中，需要有各種物質(zhì)的參與，這些元素除碳、氫、氧以有機(jī)物的形式存在外，其余的統(tǒng)稱礦物質(zhì)。身體的鈣大多分布在骨骼和牙齒中，約占總量的99%，其余1%分布在血液、細(xì)胞間液及軟組織中，這部分鈣統(tǒng)稱為混溶鈣池，它在維持正常生理活動中，起著重要作用[1]。鈣參與神經(jīng)肌肉的應(yīng)激過程，調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的各種功能，促進(jìn)腺體和神經(jīng)介質(zhì)的分泌；促進(jìn)糖原合成、分解及電解質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)；參與血液的凝固；參與維持細(xì)胞膜的通透性及完整性；參與人體免疫反應(yīng)，加快吞噬細(xì)胞的吞噬過程，增加人體的免疫力[2]。如果人體長期鈣攝入不足，就可能導(dǎo)致骨質(zhì)疏松、骨質(zhì)增生、兒童佝僂病、手足抽搐癥以及高血壓、腎結(jié)石、結(jié)腸癌、老年癡呆等疾病的發(fā)生[3]。由此可見補(bǔ)充鈣質(zhì)增強(qiáng)骨骼健康非常重要，而補(bǔ)充鈣制劑是人們補(bǔ)鈣的首選。

目前市場上的鈣制劑根據(jù)原料來源分為三類：一類是無機(jī)鈣，又稱為第一代補(bǔ)鈣產(chǎn)品如碳酸鈣、磷酸鈣及氧化鈣，這種鈣劑往往含鈣量低且難于吸收，有的因?yàn)樗苄暂^差，長期服用會引起大便干燥、食欲不振、胃疼等。第二類是有機(jī)酸鈣，即第二代鈣劑如葡萄酸鈣、檸檬酸鈣、醋酸鈣等，這種鈣劑產(chǎn)品往往存在著含鈣量低和生物利用度不高的缺陷[4]。第三類是有機(jī)鈣，即第三代鈣劑如絡(luò)合鈣，目前研究較少，價(jià)格相對來說較貴。醫(yī)學(xué)界認(rèn)為好的鈣吸收和利用與攝入鈣形態(tài)，以及適宜的鈣磷比和氨基酸的存在有密切的關(guān)系[5]。

螠蟶是一種大眾化的海產(chǎn)品，我國沿海每年都會有數(shù)十萬噸的螠蟶需要加工，大量的螠蟶貝殼不能充分利用，造成環(huán)境污染和資源浪費(fèi)。而螠蟶貝殼碳酸鈣含量非常高[6]。若利用腸道乳酸菌發(fā)酵天然富含鈣質(zhì)的螠蟶貝殼粉，由于乳酸菌代謝產(chǎn)生的酸使結(jié)合態(tài)的鈣轉(zhuǎn)變成游離的鈣離子，使無機(jī)鈣轉(zhuǎn)變成為有機(jī)鈣有利于人體對鈣的吸收。另乳酸菌是腸道有益菌，若將螠蟶貝殼粉經(jīng)發(fā)酵加工成含有菌體的補(bǔ)鈣制品，也可改善腸道的消化吸收功能[7]。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

新鮮螠蟶購于大商新瑪特黑石礁店；乳酸菌發(fā)酵劑購于北京川秀科技有限公司；檸檬酸氫二銨，葡萄糖，吐溫80，乙酸鈉，氫氧化鈉，磷酸氫二鉀，硫酸鎂，硫酸錳，蔗糖，鈣指示劑均為國產(chǎn)分析純；瓊脂粉（津Q/HB3554），蛋白胨（符合中國生物制品主要原輔料質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)），牛肉膏（QB/ABX01-009-2005）。

1.2 儀器與設(shè)備

電子天平（BS224S）：北京賽多利斯天平有限公司；離心機(jī)（LD5-2A）：北京醫(yī)用離心機(jī)廠；電熱恒溫培養(yǎng)箱（HH.BII.420-BS）、超凈工作臺（S.HS-1300）：上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠；測速氣浴振蕩器（SHZ-82A）：蘇州威爾實(shí)驗(yàn)用品有限公司；低速臺式離心機(jī)（90-2）：上海醫(yī)療器械有限公司；手提式不銹鋼蒸汽消毒器（YX280B）：上海三申醫(yī)療器械有限公司；高速萬能粉碎機(jī)（FW-100）：天津市泰斯特儀器有限公司。

2 實(shí)驗(yàn)方案

2.1 主要工藝流程

2.2 操作要點(diǎn)

2.2.1 螠蟶貝殼前處理

選市售優(yōu)質(zhì)螠蟶，將其貝殼蒸煮去雜清洗風(fēng)干，用萬能粉碎機(jī)粉碎后，分別用60目、100目、300目的篩子，篩選出粒度為60目、100目和300目的貝殼粉密封保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2.2 菌種活化

將純化的嗜熱鏈球菌和保加利亞桿菌分別接種于脫脂乳培養(yǎng)基[8]中，40℃培養(yǎng)24 h。

2.2.3 發(fā)酵螠蟶貝殼粉的乳酸菌菌種選擇

將活化的乳酸菌按保加利亞桿菌（Ⅰ）、嗜熱鏈球菌（Ⅱ）、保加利亞桿菌:嗜熱鏈球菌=1:1（Ⅲ）、以 3%的接種量在無菌條件下接種于滅菌的種子液（100目螠蟶貝殼粉15%，蔗糖5%，脫脂乳10%，蒸餾水70%）中，置于38℃～39℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。將培養(yǎng)好的3種種子液以3%的接種量在無菌條件下接種于無菌發(fā)酵培養(yǎng)基（100目螠蟶貝殼粉10%，蔗糖5%，蒸餾水85%）中，于44℃間歇振蕩培養(yǎng)發(fā)酵24 h，依次進(jìn)行活菌數(shù)，離子鈣含量測定。

2.2.4 螠蟶貝殼粉最佳發(fā)酵時(shí)間的確定

按2.2.3方法制備保加利亞桿菌:嗜熱鏈球菌體積比為1:1的乳酸菌種子液，將培養(yǎng)好的種子液以3%的接種量在無菌條件下接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中（配方同2.2.3），于 44℃間歇振蕩培養(yǎng)發(fā)酵，分別于 24、30、36 h，依次進(jìn)行活菌數(shù)，離子鈣含量測定。

2.2.5 正交試驗(yàn)優(yōu)化螠蟶貝殼粉發(fā)酵條件

按2.2.4方法制備種子液，在無菌條件下按正交試驗(yàn)方案（表1）接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，于44℃間歇振蕩培養(yǎng)發(fā)酵30 h，依次進(jìn)行活菌數(shù)，離子鈣含量測定。

由于螠蟶貝殼粉粒度（A），乳酸菌接種量（B），蔗糖濃度（C），螠蟶貝殼粉濃度（D）是直接影響發(fā)酵效果的重要因素，故將其作為本試驗(yàn)的正交因素，并選取3個(gè)水平，設(shè)計(jì)L9（34）的試驗(yàn)方案，見表1。

表1 發(fā)酵正交試驗(yàn)因素水平Table 1 Levels and factors of orthogonal experiment for fermentation

2.2.6 活菌數(shù)的測定[8]

在無菌條件下取1mL充分混勻的發(fā)酵液制備10-1、10-2、10-3、10-4、10-5系列稀釋樣液，分別取 0.1 mL 稀釋樣液均勻涂布于MRS培養(yǎng)基表面，每個(gè)樣品做3個(gè)重復(fù)，靜置使菌液滲入培養(yǎng)基內(nèi)，于40℃恒溫培養(yǎng)48 h計(jì)數(shù)。按下列公式計(jì)算每毫升樣品中的活菌數(shù)：

每毫升樣品中菌落形成單位（cfu）＝同一稀釋度的平均菌落數(shù)×稀釋倍數(shù)×10

2.2.7 螠蟶殼總鈣量的測定

稱取1g的100目螠蟶貝殼粉于小燒杯中，加入1mL蒸餾水潤濕，再從燒杯邊緣逐滴加入鹽酸溶液至粉末完全溶解，然后加熱近沸，充分?jǐn)嚢?。溶?000 r/min離心5 min除去大顆粒沉淀，上清液5000 r/min離心15 min，測定上清液中離子鈣的量，即為1 g螠蟶貝殼粉中的總鈣量。

2.2.8 離子鈣含量的測定[9]

移取2 mL發(fā)酵物離心（3000 r/min,5 min）除去大顆粒沉淀，上清液離心（5000 r/min,15 min）除去大量菌體，上清液用于測定Ca2+的含量，每個(gè)樣品重復(fù)測定3次。

準(zhǔn)確吸取1mL樣品，2mL100g/L的NaOH和10mg的鈣指示劑于錐形瓶中，用已標(biāo)定的0.01 mol/L的EDTA溶液滴定，不斷搖動錐形瓶，當(dāng)溶液變?yōu)榧兯{(lán)色時(shí)，記下滴定液的體積V。

鈣轉(zhuǎn)化率/%=發(fā)酵液離子鈣量/螠蟶殼總鈣量×100

3 結(jié)果與分析

3.1 發(fā)酵螠蟶貝殼粉的乳酸菌菌種選擇結(jié)果

以3種組合方式接種乳酸菌發(fā)酵結(jié)果檢測如表2。

表2 3種菌發(fā)酵螠蟶貝殼粉結(jié)果Table 2 The results for shell powder of Sinonovacula constricta fermented by 3 kinds lactobacillus

測定結(jié)果表明第3種方式即保加利亞乳桿菌:嗜熱鏈球菌=1:1的發(fā)酵效果好于保加利亞乳桿菌或嗜熱鏈球菌單獨(dú)發(fā)酵的效果，其發(fā)酵產(chǎn)物的活菌數(shù)和鈣離子轉(zhuǎn)化率均高于前兩組，因此確定用保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌以1:1的比例混合發(fā)酵螠蟶貝殼粉，以獲得含較多離子鈣和乳酸菌活菌的補(bǔ)鈣制劑。

3.2 螠蟶貝殼粉最佳發(fā)酵時(shí)間優(yōu)化結(jié)果

在發(fā)酵液組成和培養(yǎng)溫度相同的條件下，發(fā)酵不同時(shí)間的發(fā)酵效果如表3。

表3 螠蟶貝殼粉發(fā)酵不同時(shí)間的結(jié)果Table 3 The results for shell powder of Sinonovacula constricta fermented by diferent time

檢測結(jié)果表明培養(yǎng)30 h的發(fā)酵液的鈣離子轉(zhuǎn)化率高達(dá)21.85%，活菌數(shù)也明顯多于24 h和36 h，可見時(shí)間過長或過短都會影響發(fā)酵結(jié)果。發(fā)酵時(shí)間過短，活的乳酸菌數(shù)量較少，鈣離子得不到充分的轉(zhuǎn)化；發(fā)酵時(shí)間過長，乳酸菌進(jìn)入生長曲線的衰亡期出現(xiàn)負(fù)生長，因此發(fā)酵液中活菌數(shù)目減少，鈣離子轉(zhuǎn)化率降低可能是由于發(fā)酵后期乳酸菌的一些代謝產(chǎn)物絡(luò)合了部分離子鈣的結(jié)果。因此選擇30 h作為乳酸菌發(fā)酵螠蟶貝殼粉的時(shí)間，以獲得高質(zhì)量的補(bǔ)鈣制品。

3.3 螠蟶貝殼發(fā)酵條件正交試驗(yàn)優(yōu)化結(jié)果

螠蟶貝殼發(fā)酵條件正交試驗(yàn)優(yōu)化結(jié)果見表4。

表4 發(fā)酵條件正交試驗(yàn)優(yōu)化結(jié)果Table 4 Results of orthogonal experiment for fermentation

從正交試驗(yàn)數(shù)據(jù)和處理結(jié)果表中的極差（R）表明，對鈣離子轉(zhuǎn)化率影響最大的是螠蟶貝殼粉粒度（A）和乳酸菌接種量（B），其次是發(fā)酵液中螠蟶貝殼粉濃度（D）、蔗糖濃度（C），最佳發(fā)酵組合為 A3B3D1C2，即螠蟶貝殼粉粒度為300目、乳酸菌接種量為7%、發(fā)酵液中螠蟶貝殼粉濃度為15%、蔗糖濃度為8%。這是由于螠蟶貝殼粉顆粒越小，在發(fā)酵液中分散度越高，與乳酸菌生長代謝產(chǎn)生的乳酸接觸越充分，結(jié)合態(tài)鈣被轉(zhuǎn)化成離子鈣的效率越高；乳酸菌接種量高，發(fā)酵結(jié)束時(shí)活的乳酸菌數(shù)較多，代謝產(chǎn)生乳酸總量也較多，可使較多的結(jié)合鈣被轉(zhuǎn)化成離子鈣；螠蟶貝殼粉在15%和蔗糖濃度為8%時(shí)，更有利于乳酸菌生長繁殖，發(fā)酵結(jié)束時(shí)活菌數(shù)較多，乳酸產(chǎn)生量也較高，因此形成的離子鈣也較多，相應(yīng)的鈣離子轉(zhuǎn)化率也高，當(dāng)螠蟶貝殼粉濃度較高時(shí)，不利于乳酸菌生長，因此活菌數(shù)較少且貝殼粉中的結(jié)合鈣也不能被充分的轉(zhuǎn)化成離子鈣。

4 結(jié)論

1）本研究探索了一種用螠蟶貝殼制備乳酸菌富集鈣的工藝，螠蟶經(jīng)去肉、清洗、風(fēng)干、粉碎、滅菌、接菌和發(fā)酵等工藝制得含活性乳酸菌的生態(tài)補(bǔ)鈣制品。

2）以發(fā)酵結(jié)束時(shí)，發(fā)酵產(chǎn)品中活的乳酸菌數(shù)和鈣轉(zhuǎn)化率為檢測指標(biāo)優(yōu)化出發(fā)酵工藝條件為：用1:1的保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌作為發(fā)酵菌種，在粒度為300目的螠蟶貝殼粉、乳酸菌接種量7%、發(fā)酵液中螠蟶貝殼粉濃度15%和蔗糖濃度為8%的條件下發(fā)酵30 h。

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Preparation of Lactobacillus Enriching Calcium from Shell Powder of Sinonovacula constricta

ZHANG Fu-yun,LI Yun-bing,YANG Qing-yu,LI Yan,WANG Bin,YANG Yang,CANG Gui-lu
（College of Food Engineering,Dalian Ocean University，Dalian 116023,Liaoning,China）

To developing new biological calcium product,two kinds of lactobacillus were used for ferment the shell powder of Sinonovacula constricta.The ferment conditions were defined through comparing the total number of live lactobacilli and the conversion of ionic calcium.Research results suggest that the optimal conditions were adding 15%shell powder of 300 mesh,8%sugar and 7%admixture of lactobacillus bulgaricus and streptococcus thermophilus,fermentation for 30 h.

shell powder of Sinonovacula constricta;lactobacillus bulgaricus;streptococcus thermophilus;ionic Ca

遼寧省教育廳科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目（2009A164）；大連市科學(xué)技術(shù)基金（2010J21DW017）

張付云（1969—），女（漢），副教授，博士，研究方向：海洋資源綜合利用。

2011-12-06