宋勇 薛武軍 田普訓(xùn) 丁小明 馮新順 田曉輝 宋煥瑾 李楊

目前治療1型糖尿病的主要方法有胰島素注射、胰腺移植和胰島移植。胰島移植是治療胰島素依賴(lài)型糖尿病(insulin dependant diabetes mellitus，IDDM)的一種最符合生理需求且有效的方法，它是將外源性具有生理功能的胰島細(xì)胞移植于患者，實(shí)現(xiàn)全內(nèi)分泌替代治療，通過(guò)對(duì)血糖進(jìn)行持續(xù)監(jiān)測(cè)和精細(xì)調(diào)節(jié)，以更接近人體自身生理的方式，使糖代謝恢復(fù)正常而不增加低血糖的發(fā)生率，從而防止或減緩心、腎和眼等病變的發(fā)展。盡管胰島細(xì)胞移植已取得很大進(jìn)展，但仍無(wú)法在臨床大規(guī)模應(yīng)用，這主要是由于胰島移植仍存在一些問(wèn)題。其中主要的是宿主免疫排斥反應(yīng)。同時(shí)，由于胰島本身是一個(gè)無(wú)血管的移植物，在其重建血管化的幾天內(nèi)很容易因缺乏營(yíng)養(yǎng)而窒息死亡。因此如何提高胰島移植后的活性成為胰島移植研究的一個(gè)重點(diǎn)。

組織工程技術(shù)的發(fā)展使人工胰腺發(fā)展迅速，為胰島移植提供了更多方法。目前存在的一些無(wú)免疫抑制劑胰島移植技術(shù)（例如微囊化胰島和大包囊胰島等）為胰島移植提供了新的思路。本研究自2008年5月至2009年3月利用豬小腸黏膜下層（small intestinal submucosa，SIS）與組織細(xì)胞有良好的組織相容性特點(diǎn)[1]，用其作支架材料重建胰島營(yíng)養(yǎng)支持的微環(huán)境，改善胰島存活，旨在探討將兩者體外復(fù)合培養(yǎng)構(gòu)建組織工程胰腺的可行性，為其體內(nèi)胰腺移植使用打好前期基礎(chǔ)。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與主要儀器試劑

供體均為雄性遠(yuǎn)交群（sprague dawley，SD）大鼠，體重200～280 g，由西安交通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。其他試劑和儀器包括：Ⅴ型膠原酶（美國(guó)Sigma公司），RPMI 1640培養(yǎng)基（美國(guó)Hyclone公司），OLYMPUS相差顯微鏡，低溫離心機(jī)（美國(guó)Thermo Forma公司），掃描電鏡（荷蘭FEIQuanTa 200 Philips），透射電鏡（日本 JEM-200CX），新生牛血清（杭州四季青生物制品公司），雙硫腙（dithizone，美國(guó)Sigma公司），胎牛血清（美國(guó)Hyclone公司），Hank緩沖液（美國(guó)Sigma公司），F(xiàn)icoll液（美國(guó)Sigma公司），6孔培養(yǎng)板（美國(guó)Corning公司）和丫啶橙（acridine orange,AO）/碘化丙啶（propidium iodide,PI）（美國(guó) Sigma公司）。

二、SIS的制備

1.物理方法：取屠宰4 h內(nèi)的新鮮豬小腸，將小腸的漿膜層和肌層用裹有紗布的刀柄去除，用40℃水持續(xù)沖洗干凈。

2.化學(xué)方法：參考Abraham方法[2]把用物理方法處理的小腸在室溫下經(jīng)過(guò)一系列化學(xué)方法處理，材料與溶液的體積比例保持在1:100。（1）將機(jī)械方法制得的SIS浸泡在含有100mmol/L乙二胺四乙酸(Ethylene Diamine Tetraacetic Acid，EDTA)和10mmol/L NaOH 溶液中(pH 11～12) 16 h；（2）用去離子水將基質(zhì)沖洗干凈，在含有1mmol/L HCl和1mmol/L NaCl溶液中(pH 0～1)浸泡6～8h；（3）用去離子水沖洗基質(zhì)后，在1mmol/L NaCl的磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer，PBS)中浸泡 16 h ；（4）用去離子水沖洗基質(zhì)后，在PBS溶液中(pH 7.0～7.4)浸泡2h；（5）再用去離子水沖洗基質(zhì)2h(pH 5.8～7.0)；（6）殺菌：將SIS在含0.1﹪的過(guò)氧乙酸的20﹪乙醇溶液中浸泡8h，用含0.05﹪疊氮化鈉的PBS溶液清洗2h，-70℃凍干，γ射線照射(25～35 kGy)滅菌。

三、改良的胰島分離、純化與培養(yǎng)

1.胰腺的獲?。喊?﹪戊巴比妥鈉120 mg/kg行SD大鼠腹腔注射麻醉，無(wú)菌條件下剖腹，顯露膽總管。于膽總管上端剪一小口并插入5號(hào)頭皮針，結(jié)扎固定，夾閉胰管遠(yuǎn)端與小腸匯合處。剪破心臟處死大鼠，膽總管內(nèi)緩慢注入1.5 mg/mlⅤ型膠原酶使胰腺膨脹，完整剪下胰腺放入Hank緩沖液10～12ml。

2.胰島的分離：將剪下的胰腺于38℃水浴震蕩器中放置10～15min，以100次/min振蕩2～3min，于4℃將未消化完全的胰腺撕碎，人工振蕩20～40次，加入冷Hank液至50ml，80目網(wǎng)篩過(guò)濾。濾至預(yù)冷的加有滅活胎牛血清的Hank乳酸鈉林格氏液中，以終止消化。為了減少消化過(guò)程對(duì)胰島的損傷，在終止消化的Hank乳酸鈉林格氏液中均加入了牛血清白蛋白[3-4]。消化液于4℃，離心半徑13.5 cm，1000 r/min平衡離心1～2min，棄上清液，冷Hank液再洗滌離心1次，終止消化。

3.胰島的純化：將上述制備的沉淀物用Hank液再離心洗滌1次，將25﹪ Ficoll溶液4ml與需純化的胰島細(xì)胞充分混勻，放置于離心管底部，再依次加23﹪、20﹪和11﹪的Ficoll溶液各2ml，4℃離心半徑13.5 cm，2000 r/min離心15min后，吸出20﹪～23﹪界面的細(xì)胞，洗滌后培養(yǎng)于RPMI1640培養(yǎng)液(含10﹪的胎牛血清)中。

四、胰島與SIS復(fù)合體體外構(gòu)建胰腺

將胰島以5.0×105個(gè)/孔密度接種于6孔培養(yǎng)板，每孔加2 cm×2 cm SIS材料1塊。在37℃的5﹪CO2飽和濕度條件下復(fù)合培養(yǎng)，每3天更換1次培養(yǎng)液。一定時(shí)間后取出SIS用于觀察及檢測(cè)。

五、相差顯微鏡觀察

逐日在相差顯微鏡下觀察培養(yǎng)基有無(wú)混濁、細(xì)胞生長(zhǎng)及與生物材料附著情況和SIS形態(tài)變化。

六、AO/PI雙染色

將適量AO、PI分別溶于Dulbecco乳酸鈉林格氏液中，使AO的終濃度為670 μmol/L，PI的終濃度為750 μmol/L。臨用前取0.01ml AO與1ml PI混合，用Dulbecco乳酸鈉林格氏液稀釋10倍，用0.22 μm濾膜過(guò)濾除菌，然后將胰島避光染色10min，在熒光顯微鏡下用429 nm激發(fā)光激發(fā)，可看到呈綠色熒光的活細(xì)胞；使用555 nm激發(fā)光激發(fā)，可看到呈紅色熒光的死細(xì)胞。

七、生物學(xué)活性測(cè)定

胰島素釋放試驗(yàn)：用Hank液分別配制濃度為3.3mmol/L的低糖培養(yǎng)液和16.7mmol/L的高糖培養(yǎng)液。純化后的60個(gè)胰島置于低糖培養(yǎng)液中，在37℃的5﹪CO2培養(yǎng)箱中孵育4 h，然后用高糖培養(yǎng)液置換低糖培養(yǎng)液，再孵育4 h，分別收集上清液用放射免疫法測(cè)定胰島素含量。

八、掃描電鏡觀察

將胰島與SIS復(fù)合培養(yǎng)分別于培養(yǎng)第3、5、7、10天及2周將培養(yǎng)孔內(nèi)生物材料取出，2.5﹪戊二醛固定，系列丙酮中脫水，乙酸異戊酯置換，臨界點(diǎn)干燥，表面噴金后上機(jī)觀察骨髓間充質(zhì)干細(xì) 胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMMSCs）在SIS上的附著與生長(zhǎng)情況。

九、透射電鏡觀察

將胰島與SIS復(fù)合培養(yǎng)3、5、7、10d及2周后，2.5﹪戊二醛固定，系列丙酮中脫水，浸透及環(huán)氧樹(shù)酯包埋，超薄切片機(jī)切片，醋酸鈾-檸檬酸鉛雙染色，透射電鏡觀察BM-MSCs中的細(xì)胞器變化情況。

十、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 17.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。胰島素測(cè)定結(jié)果用表示，組間差異用獨(dú)立t檢驗(yàn)分析，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、相差顯微鏡觀察培養(yǎng)細(xì)胞

SIS復(fù)合胰島培養(yǎng)時(shí)，2～4 d培養(yǎng)期內(nèi)胰島變化不明顯，單純培養(yǎng)的胰島細(xì)胞團(tuán)呈裂解小塊或不規(guī)則形。SIS復(fù)合培養(yǎng)胰島在第7天后材料周?chē)休^多胰島直接貼附于材料邊緣，10d后大量細(xì)胞聚集材料邊緣(圖1a)，多為橢圓，邊界清晰，DTZ染色為猩紅色，凋亡減少(圖1b)。

二、AO/PI雙染色

大部分胰島細(xì)胞團(tuán)呈綠色，表明細(xì)胞的活性良好，計(jì)算多個(gè)視野細(xì)胞的存活率，平均存活率92﹪(圖1c)。

圖1 相差顯微鏡觀察培養(yǎng)的胰島細(xì)胞

三、胰島素測(cè)定

從純化后的胰島中挑選60個(gè)，分別在6孔板進(jìn)行單純培養(yǎng)和SIS共培養(yǎng)3 d，采用低糖及高糖刺激，并測(cè)定不同條件下胰島素分泌情況。低糖情況下胰島素分泌量為( 22.35±3.43 )mmol/L，高糖情況下為( 37.79±4.27 )mmol/L，兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義( t=21.84，P=0.00 )(表1)。

表1 SIS組和對(duì)照組胰島素釋放結(jié)果(mmol/L，)

表1 SIS組和對(duì)照組胰島素釋放結(jié)果(mmol/L，)

注：SIS為小腸黏膜下層

組 別 低糖下胰島素(3.3mmol/L)高糖下胰島素(16.7mmol/L) t值 P值SIS組 22.35±3.43 37.79±4.27 21.840 0.000對(duì)照組 21.45±2.38 28.67±3.58 13.009 0.000 t值 1.670 12.678 P值 0.098 0.000

四、掃描電鏡觀察

體外復(fù)合培養(yǎng)時(shí)，在SIS光滑面生長(zhǎng)的胰島粗糙面較少。復(fù)合培養(yǎng)5 d，細(xì)胞散在材料表面，呈長(zhǎng)梭形或不規(guī)則形，細(xì)胞間無(wú)連接。胞體表面有顆粒狀物，可見(jiàn)微絲形成并附著在材料表面(圖2a)。培養(yǎng)7 d后細(xì)胞數(shù)量明顯增多，細(xì)胞分泌旺盛，細(xì)胞間有大量膠原纖維絲，形成細(xì)胞間連接。部分細(xì)胞跨越孔隙，呈長(zhǎng)梭形，有些正在分裂，有些重疊生長(zhǎng)。培養(yǎng)10d后胰島呈三維生長(zhǎng)(圖2b)。

五、透射電鏡觀察

胰島在SIS上呈多層生長(zhǎng)，細(xì)胞連接緊密。胞體成梭形，膜表面有微絨毛狀突起，細(xì)胞核呈梭形或不規(guī)則形，偶見(jiàn)有分葉形，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)豐富、擴(kuò)張和增粗，有大量異噬體等次級(jí)溶酶體，線粒體體積較小，高爾基氏體可見(jiàn)小囊泡，細(xì)胞間基質(zhì)致密。隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，靠近SIS表面的細(xì)胞粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)數(shù)量較最上層細(xì)胞少，細(xì)胞出現(xiàn)老化現(xiàn)象。培養(yǎng)2周后靠近SIS的內(nèi)層細(xì)胞老化更明顯(圖2c)。

討 論

組織是由細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)構(gòu)成的。ECM是細(xì)胞微環(huán)境的主要成分，不僅為各種細(xì)胞提供骨架結(jié)構(gòu)與附著位點(diǎn)，而且在細(xì)胞的黏附、遷移、增殖、分化、組織特異性維持和凋亡誘發(fā)相關(guān)基因表達(dá)抑制等方面發(fā)揮著重要作用。不僅如此，ECM由細(xì)胞分泌，反過(guò)來(lái)又對(duì)細(xì)胞的增殖分化起著支持與誘導(dǎo)作用。胰島基膜由Ⅳ型膠原、層黏連蛋白和纖連蛋白組成[5]。胰島的分離和純化過(guò)程不僅破壞間質(zhì)，也使胰島周?chē)幕|(zhì)遭到破壞?；诖?，本研究嘗試將胰島放置于包被天然ECM材料(如SIS)的培養(yǎng)板上進(jìn)行培養(yǎng)，力圖重構(gòu)原有ECM結(jié)構(gòu)，恢復(fù)細(xì)胞功能。在組織工程中，種子細(xì)胞的功能有賴(lài)于ECM的存在。有了合適的ECM替代物，組織就可能完全再生。

圖2 圖a為掃描電鏡下豬小腸黏膜下層復(fù)合培養(yǎng)大鼠胰島細(xì)胞5 d 后胰島細(xì)胞散在材料表面，呈長(zhǎng)梭形或不規(guī)則形，細(xì)胞間無(wú)連接（×900）；圖b為掃描電鏡下豬小腸黏膜下層復(fù)合培養(yǎng)大鼠胰島細(xì)胞10d 后胰島細(xì)胞間微絲連接，呈三維生長(zhǎng)（×900）；圖c為掃描電鏡下豬小腸黏膜下層復(fù)合培養(yǎng)大鼠胰島細(xì)胞14 d 胰島粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)數(shù)量較少（×1000）

研究已經(jīng)表明，支架材料表面的化學(xué)和物理性能會(huì)影響種子細(xì)胞的黏附和增殖[5]。因此，組織工程的理想支架材料除了有良好的組織相容性，沒(méi)有抗原作用，有一定的孔隙率和機(jī)械強(qiáng)度，降解性和降解速率可以控制以外，還必須能夠維持在其上面生長(zhǎng)的細(xì)胞形態(tài)和表型，增進(jìn)細(xì)胞的黏附和增殖，誘導(dǎo)組織的再生。SIS是一種天然ECM生物材料，含有活性生長(zhǎng)因子，較其他用于組織工程的合成材料(如聚乳酸)優(yōu)越。McDevitt等[6]從SIS中提取出轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β，盡管在制備過(guò)程中經(jīng)受過(guò)消毒和凍干等處理，仍具有生物活性[7]，既可以促進(jìn)間充質(zhì)細(xì)胞分化和增殖，又能刺激成骨細(xì)胞和成軟骨細(xì)胞增殖，增加Ⅰ型膠原、骨連接蛋白和骨橋蛋白合成[8]。Hodde等[9]也證實(shí)SIS的ECM中有血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子，以及與促內(nèi)皮細(xì)胞分裂素有密切關(guān)系的血小板源生長(zhǎng)因子。SIS所固有的這些生長(zhǎng)因子，在組織的修復(fù)和重構(gòu)中有著重要的促進(jìn)作用。

在胰島的體外培養(yǎng)研究中，多年來(lái)一直采用二維靜態(tài)培養(yǎng)，由于培養(yǎng)器皿中氧氣、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)及代謝產(chǎn)物分布的不均勻性，且由于胰島的團(tuán)狀結(jié)構(gòu)，其活性會(huì)因營(yíng)養(yǎng)及氧氣缺乏而迅速降低。隨著空間生命科學(xué)的發(fā)展，已建立起來(lái)的一種三維立體培養(yǎng)體系，它通過(guò)細(xì)胞生物支架培養(yǎng)液與細(xì)胞的有機(jī)結(jié)合，使培養(yǎng)細(xì)胞始終處于一種立體三維狀態(tài)，使培養(yǎng)體系中營(yíng)養(yǎng)及代謝產(chǎn)物分布更加均勻，氣體交換更加充分，從而防止胰島細(xì)團(tuán)內(nèi)部的細(xì)胞因缺乏氧氣和營(yíng)養(yǎng)而壞死。SIS模擬細(xì)胞外微環(huán)境，可以促進(jìn)胰島的正常轉(zhuǎn)化和再組織化，從而構(gòu)建肉眼可見(jiàn)的、組織樣三維結(jié)構(gòu)。無(wú)論是實(shí)驗(yàn)還是臨床，都曾用SIS作材料進(jìn)行組織缺損的修復(fù)[9]。實(shí)驗(yàn)表明，經(jīng)過(guò)長(zhǎng)達(dá)2周的培養(yǎng)，胰島分泌胰島素的功能仍很活躍，細(xì)胞融合后接觸抑制不明顯，并且在SIS上重疊生長(zhǎng)。

本研究證實(shí)，利用SIS制作的三維支架材料具有空間定位，可供細(xì)胞遷移，與胰島在體外復(fù)合培養(yǎng)時(shí)，細(xì)胞在支架的表面附著良好。隨著換液和培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，SIS上胰島同時(shí)可以附著于材料的孔隙周邊或深入材料孔隙內(nèi)生長(zhǎng)，復(fù)合組織逐漸變厚，這就為開(kāi)展組織工程胰島的臨床移植奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。本研究結(jié)果提示，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，底層細(xì)胞的活力比上層細(xì)胞的活力減弱。因此，選擇植入體內(nèi)的合適時(shí)間將是下一步研究的內(nèi)容之一。總之，將分離后的胰島細(xì)胞與SIS共培養(yǎng)能夠較好的維持胰島的生物學(xué)功能和活力，使胰島細(xì)胞移植成為更理想的糖尿病治療措施。

1 張開(kāi)剛,曾炳芳,張長(zhǎng)青.小腸黏膜下層的制備及細(xì)胞相容性的實(shí)驗(yàn)研究[J].中華創(chuàng)傷骨科雜志,2004,7(4):344-348.

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