黃 沂，張志鋒，施 烯，張 帆，林學(xué)德

(福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院化療科，福建福州 350005)

胃癌是消化系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，世界范圍內(nèi)，胃癌位居目前腫瘤死亡的第二位［1］。胃癌死亡率高的原因與該病發(fā)現(xiàn)時多為中晚期或術(shù)后易復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移有關(guān)，晚期胃癌預(yù)后惡劣，治療上以化療為主，5年生存率不足10%［2］。尿激酶型血漿纖溶酶原激活系統(tǒng)(The urokinase plasminogen activating system，uPAS)已被認為是促進胃癌發(fā)展和轉(zhuǎn)移的一個重要因素。轉(zhuǎn)錄活化因子NF-κB可激活與浸潤轉(zhuǎn)移相關(guān)的某些重要因子的表達從而發(fā)揮其在腫瘤進展中的重要作用，這些因子包括尿激酶型血纖維蛋白溶酶原激活劑。近年來除了化療藥物，一些新的分子靶向藥物如曲妥珠單抗、貝伐單抗等已經(jīng)被用到治療胃癌，硼替佐米(PS-341，bortezomib)是一種新型蛋白酶體抑制劑，已被批準(zhǔn)用于多發(fā)性骨髓瘤和淋巴瘤的治療［3］，其治療多發(fā)性骨髓瘤的最公認的機制就是抑制NF-κB［4］，另外一個 II期臨床研究顯示硼替佐米聯(lián)合CPT-11治療晚期胃癌有一定療效［5］。本試驗?zāi)康臑橛^察硼替佐米對人胃癌SGC-7901細胞uPA、NF-κB表達的影響及與其侵襲力關(guān)系，進而探討硼替佐米抗胃癌的可能機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及藥品 M199培養(yǎng)基(Gibco)，胎牛血清(Gibco)，胰蛋白酶(Gibco)，PBS(北京中杉)，Western印跡化學(xué)發(fā)光試劑(Santa Cruz公司);硝酸纖維素膜(Amersham公司);抗 β-actin、小鼠抗人NF-κB抗體(STC公司)，辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗鼠IgG(Santa Cruz公司);BRDU ELISA(試劑盒(ROCHE公司);其他常用試劑均為分析純。

2 方法

2.1 體外胃癌SGC-7901細胞的培養(yǎng) 無菌條件取液氮中胃癌SGC-7901細胞快速置于37℃水浴溶解，吸取至預(yù)先放置有5ml DMEM離心管中，3 500 r·min－1離心10 min，棄上清，加5 ml 10%FCS 完全培養(yǎng)基重懸后置于培養(yǎng)瓶，37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng);d 2更換培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，每3天更換1/2培養(yǎng)基;待細胞長至80% ～90%匯合時，0.25%胰酶消化以1∶3傳代，取傳3～5代細胞進行實驗。

2.2 BRDU ELISA法檢測胃癌SGC-7901細胞增殖活性 用0.25%胰酶消化胃癌細胞SGC-7901接種于96孔培養(yǎng)板中，104細胞/孔，24 h更換0.2%FCS培養(yǎng)基90μl/well 24 h，加入含不同濃度硼替佐米10 μl/well，繼 續(xù) 培 養(yǎng)24 h;加 入10×BRDU 10μl/wel 37℃ 孵育2 ～ h; 棄上清，加100 μ Fixnat固定液 30 min，棄上清，加100 μl/well PBS 洗滌1次，加anti-BRDU-POD抗體100 μl/well室溫60～90 min，棄上清，加 100 μl/well PBS 洗滌 3 次，5分鐘/次，加顯色底物100 μl/well 10～20 min;加25 μl/well硫酸(1 mol·L－1)450 nm酶標(biāo)儀檢測其OD值，用OD值大小表示細胞活性。

2.3 胃癌SGC-7901細胞遷移實驗 聚碳微孔膜用0.01%Gelatin煮沸1 h，晾干，采用改良的Boyden微孔膜雙槽法進行細胞遷移實驗，下槽加入不同的趨化刺激物，用8 μm孔徑的聚碳微孔膜隔開上下槽，上槽加入0.4ml密度2.5 ×108cells·L－1細胞懸液(細胞總數(shù)為1×105)。置于37℃ 5%CO2培養(yǎng)箱，孵育4 h后棄去上槽細胞懸液，聚碳微孔膜移至染色架，95%乙醇固定10 min，0.5%甲苯胺蘭染色40 min，用棉簽輕輕刮去聚碳微孔膜朝上槽的細胞，壓片固定，光學(xué)顯微鏡觀察，每張膜隨機取5個高倍視野(×200)并計算細胞數(shù)，每組做5張膜，求均值。

2.4 Western blot測定胃癌 SGC-7901細胞 Upa，NF-κB蛋白表達 胃癌 SGC-7901細胞干預(yù)完成后，于6孔板中加入200 μl 1×SDS裂解液(臨用前加入 5 × DTT 液，100 ml·L－1PMSF，2 ml·L－1Aprotinin)冰上10 min，將液體轉(zhuǎn)至無菌的1.5 ml聚丙烯離心管中振蕩30 s，立即放入水浴鍋中100℃煮10 min，4℃ 12 000×g離心10 min，取上清－70℃保存待用。10% 不連續(xù)SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉的TBS中封閉30 min，加Upa、NF-κB 抗體(1 ∶1 000)4℃過夜，TBS漂洗3×5 min。將膜與辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG(1∶5 000)37℃搖1 h，TBS洗滌3×5 min;滴加魯米諾混合液，X線膠片曝光;洗片，顯影信號的強弱用光密度分析值反映。以總β-actin為內(nèi)參照，進行半定量分析，比值表示其相對含量。

2.5 胃癌SGC-7901細胞核蛋白提取 0.25%胰酶消化細胞，PBS 重懸，1 500 r·min－1離心 10 min，加入低滲液200 μl，混勻，室溫靜置10 min;12 000×g離心5 min，棄上清，加入 1 × SDS 100 μl，混勻，煮沸10 min;12 000×g離心10 min，吸取上清于－80℃保存待測。

2.6 細胞免疫化學(xué)測胃癌SGC-7901細胞NF-κB核蛋白含量與定位 胰蛋白酶消化細胞接種于6孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)板中預(yù)先置入高壓消毒的蓋玻片，在37℃二氧化碳培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng);待蓋玻片上細胞近70% ～80%匯合時，吸棄原培養(yǎng)液，換用含0.2%FBS的DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h后進行干預(yù)，干預(yù)結(jié)束后取出蓋玻片，PBS沖洗，4%多聚甲醛室溫固定30 min，PBS沖洗5 min×3;0.1%Triton X-100通透 30 min，PBS沖洗 5 min×3;加 NF-κB 抗體(2.5 mg·L－1)，室溫孵育60 min，PBS 沖洗5 min ×3;加HRP標(biāo)記二抗(1∶100)，室溫孵育60 min，PBS沖洗5 min×3，DAB顯色，鏡下觀察，涼干，封片。

3 結(jié)果

3.1 硼替佐米對10%FCS血清誘導(dǎo)的胃癌SGC-7901細胞增殖活性的影響 與對照組(無血清培養(yǎng)基組)相比，10%FCS組SGC-7901細胞活性明顯增加;與10%FCS組相比，硼替佐米呈濃度依賴性抑制血清誘導(dǎo)人胃癌SGC-7901細胞增殖，硼替佐米濃度為4 μg·L－1時，人胃癌SGC-7901細胞增殖活性明顯降低(P＜0.01);與 PDTC(10 μmol·L－1)組相比，兩組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(見Fig 1)。

Fig 1 Effect of bortezomib on the proliferation of human SGC-7901 cells induced by 10%FCS(n=6)

3.2 硼替佐米對胃癌SGC-7901細胞遷移的影響

與對照組(無血清培養(yǎng)基組)相比，10%FCS組SGC-7901細胞遷移率明顯增高;與10%FCS組相比，硼替佐米呈濃度依賴性抑制血清誘導(dǎo)人胃癌SGC-7901細胞的遷移;當(dāng)硼替佐米濃度為4 μg·L－1時，人胃癌SGC-7901細胞遷移率明顯下降(P＜0.05);與 PDTC(10 μmol·L－1)組相比，兩者無明顯差別(見Fig 2A、B)

Fig 2 Effect of bortezomib on the migration of human SGC-7901 cells induced by 10%FCS

3.3 硼替佐米對胃癌SGC-7901細胞UPA、NF-κB蛋白表達的影響 與對照組(無血清培養(yǎng)基組)相比，10%FCS能促進 SGC-7901細胞 uPA、NF-κB 的表達;與10%FCS組相比，硼替佐米呈濃度依賴性抑制胃癌SGC-7901細胞的uPA、NF-κB表達水平;當(dāng)硼替佐米濃度為4 μg·L－1時，人胃癌SGC-7901細胞uPA、NF-κB表達水平明顯下降(P＜0.05)，與PDTC組相比無明顯差別(P＞0.05)(見Fig 3A，B)。3.4 硼替佐米對10%FCS誘導(dǎo)胃癌SGC-7901細胞NF-κB核移位及含量的影響 與對照組相比，10%FCS組胃癌SGC-7901細胞的NF-κB核蛋白明顯增加;與10%FCS組相比，硼替佐米組(4 μg·L－1)及 PDTC(10 μmol·L－1)組胃癌 SGC-7901 細胞NF-κB核蛋白含量明顯下降(P＜0.05);細胞免疫化學(xué)示:無血清培養(yǎng)基條件下，胃癌SGC-7901細胞棕色顆粒呈均勻分布，細胞核中未見明顯棕黃色顆粒，10%FCS組可見細胞核大量棕色顆粒沉著;硼替佐米(4 μg·L－1)組及 PDTC(10 μmol·L－1)組，細胞核內(nèi)可見少量棕色顆粒(見Fig 4A，B;Fig 5)。

Fig 3 Effect of bortezomib on the expression levels of UPA and NF-κB in human SGC-7901 cells induced by 10%FCS

4 討論

尿激酶型纖溶酶原激活物(uPA)為激酶型血漿纖溶酶原激活系統(tǒng)的重要成員之一，諸多試驗證明，纖溶功能亢進是胃癌細胞易播散、浸潤的主要原因之一，并且在一定程度上，腫瘤細胞分泌uPA或表達uPA受體的水平與其降解細胞外基質(zhì)及侵襲轉(zhuǎn)移能力呈正相關(guān)［6］，被認為是促進胃癌發(fā)展和轉(zhuǎn)移的一個重要因素。

NF-κB可激活與浸潤轉(zhuǎn)移相關(guān)的某些重要因子的表達從而發(fā)揮其在腫瘤進展中的重要作用，這些因子包括表皮生長因子、基質(zhì)金屬蛋白酶、尿激酶型血纖維蛋白溶酶原激活劑。對胃癌及癌旁組織的免疫組織化學(xué)分析表明，胃癌組織中的有NF-κB活性較癌旁組織中的明顯增高，且腫瘤組織中NF-κB活性與uPA表達呈正相關(guān)［7］。用白細胞介素刺激胃癌HTB2135細胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著NF-κB活性增加，uPAmRNA表達水平亦增加，進一步證實NF-κB對uPA 的調(diào)節(jié)作用。Sasaki等［8］還發(fā)現(xiàn)，NF-κB 活性還與胃癌的淋巴轉(zhuǎn)移、腫瘤大小、病理分期、外科手術(shù)治療、腫瘤浸潤深度、腹膜轉(zhuǎn)移、化療耐藥性等臨床病理特征有關(guān)，并與患者的預(yù)后密切相關(guān)，NF-κB高者，預(yù)后較差。

Fig 4 Effect of bortezomib on the level of NF-κB(p65)in human SGC-7901 gastric cancer cells induced by 10%FCS

Fig 5 Effect of bortezomib on the translocation NF-κB(p65)in human SGC-7901 gastric cancer cells induced by 10%FCS

硼替佐米是首個被用于臨床的蛋白酶體抑制劑，通過抑制26s蛋白酶體，從而阻礙泛素－蛋白酶體通路對IκB的降解，因此通過維持胞質(zhì)內(nèi)的IκB濃度，抑制NF-κB進入細胞核內(nèi)，減少其轉(zhuǎn)錄活性［9］。其抗腫瘤機制:①作用于轉(zhuǎn)錄活化因子(NF-κB);②對細胞周期的調(diào)控;③ 逆轉(zhuǎn)化療抵抗;④抗血管生成。但國內(nèi)外目前研究硼替佐米對抗胃癌的機制較少，曾有一些初步研究顯示硼替佐米能引起胃癌細胞的基因改變，包括凋亡、PI3K和MAPK信號通路的改變［10］;Nakata等［11］研究顯示硼替佐米促進胃癌細胞的凋亡依賴于其抑制NF-κB通路。硼替佐米對胃癌的遷移方面的機制國內(nèi)外鮮有文獻報道。我們的研究結(jié)果首次報道了4 μg·L－1的硼替佐米即能夠明顯的抑制人胃癌SGC-7901細胞的增殖和遷移，并且該濃度的硼替佐米能明顯抑制SGC-7901細胞uPA、NF-κB蛋白表達水平，硼替佐米對NF-κB的抑制能媲美NF-κB的特異性抑制劑。上述結(jié)果提示:硼替佐米能夠抑制NF-κB的表達，進而抑制尿激酶型血漿纖溶酶原激活系統(tǒng)，最終降低胃癌的侵襲力。

我們的試驗結(jié)果為硼替佐米抗胃癌的遷移能力提供了一個新的證據(jù)，并且提示硼替佐米降低胃癌SGC-7901細胞侵襲力的機制可能與其抑制NF-κB活性，降低uPA水平有關(guān)。這一研究結(jié)果顯示硼替佐米或許能成為未來胃癌的內(nèi)科治療方面，尤其是術(shù)后預(yù)防腫瘤遠處轉(zhuǎn)移方面的一種理想的藥物。

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