姜文靜，牛膺筠

(1.青島市海慈醫(yī)療集團(tuán)眼科，山東 青島 266033;2.青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院眼科，山東 青 島 266003)

眾所周知，適量的光線對(duì)視覺(jué)的形成是非常必要的。相反，如果光線的強(qiáng)度、光照的時(shí)間等超過(guò)了視網(wǎng)膜的承受力，那么將會(huì)造成視網(wǎng)膜的光損傷。光損傷后視網(wǎng)膜成分的丟失可能涉及凋亡，而Caspase-3是細(xì)胞凋亡的的必經(jīng)之路。重組人促紅細(xì)胞生成素(rhEPO)可抑制光化學(xué)損傷誘導(dǎo)的人RPE細(xì)胞的凋亡，對(duì)人RPE細(xì)胞的光化學(xué)損傷有保護(hù)治療作用［1］。本課題建立光損傷模型，應(yīng)用外源性EPO進(jìn)行治療，觀察EPO與凋亡、Caspase-3的關(guān)系，探討EPO的保護(hù)作用，為其臨床應(yīng)用治療視網(wǎng)膜光損傷類疾病提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 52只♂BALB/c小鼠，體質(zhì)量12～20 g，隨機(jī)分為對(duì)照組(4只)、單純光照組(24只)和EPO預(yù)處理組(24只)3組。后兩組按光照后處死時(shí)間的不同，分為6 h、12 h、36 h、72 h、96 h 和7 d 6 個(gè)亞組。

1.2 試劑 3 000 U/ml rhEPO(沈陽(yáng)三生制藥公司)，caspase-3兔IgG多抗(武漢博士德公司)，PV6001二步法免疫組化檢測(cè)試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法 將48只BALB/c小鼠放于6000LUX光照箱前，EPO預(yù)處理組和單純光照組小鼠分別腹腔注射rhEPO和等量生理鹽水，劑量為5 000 U·kg－1。光照箱由中國(guó)海洋大學(xué)光學(xué)研究室研制。分別于光照后6 h、12 h、36 h、72 h、96 h及7 d處死4只小鼠，摘除眼球，制作石蠟切片。同文獻(xiàn)［2］。應(yīng)用光鏡HE染色法觀察各組小鼠視網(wǎng)膜色素上皮層形態(tài)學(xué)的改變，常規(guī)免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)RPE中Caspase-3的表達(dá)變化。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS10.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)用±s表示，兩組數(shù)據(jù)比較采用t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 HE染色結(jié)果 正常BALB/c小鼠視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)層次分明，RPE細(xì)胞呈單層線狀排列，細(xì)胞形態(tài)規(guī)整。光照后各亞組隨時(shí)間推移分別出現(xiàn)RPE細(xì)胞水腫，排列疏松，邊界不清、形態(tài)不規(guī)則，后期出現(xiàn)核濃染、核破碎及丟失現(xiàn)象。EPO預(yù)處理組小鼠視網(wǎng)膜組織學(xué)改變較晚發(fā)生且不明顯，光照后7 d也未見(jiàn)細(xì)胞丟失現(xiàn)象。

2.2 Caspase-3的表達(dá)變化 正常組沒(méi)有檢測(cè)到棕黃色的陽(yáng)性染色;單純光照后各亞組均可見(jiàn)到陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞，且隨光照后時(shí)間的推移陽(yáng)性表達(dá)呈現(xiàn)逐漸遞增的趨勢(shì)，光照后96 h，caspase-3陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)達(dá)到最高峰;光照后7 d，Caspase-3蛋白的表達(dá)又開(kāi)始下降。EPO預(yù)處理組僅光照后96 h組和7 d組有少量陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)。兩組同時(shí)間段相比較差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見(jiàn)Tab 1。

Tab 1 Level of expression of Caspase-3 gene in retinal pigment epithelium within different time between light-induced group and EPO pretreatment group(The average optical density value，±s，n=8)

Tab 1 Level of expression of Caspase-3 gene in retinal pigment epithelium within different time between light-induced group and EPO pretreatment group(The average optical density value，±s，n=8)

＊＊P＜0.01 vs control group

Time light-induced group EPO pretreatment group t P 6 h 18.88 ±3.14＊＊2.78 ±2.56 11.24 ＜0.01 12 h 24.83 ±4.53＊＊ 3.34 ±2.12 12.15 ＜0.01 36 h 44.92 ±3.64＊＊ 3.98 ±3.14 24.09 ＜0.01 72 h 92.26 ±4.67＊＊ 4.75 ±2.63 46.18 ＜0.01 96 h 297.28 ±2.23＊＊ 20.43 ±2.62＊＊ 227.59 ＜0.01 7 d 167.95 ±3.28＊＊ 15.78 ±3.96＊＊83.70 ＜0.01

3 討論

本研究視網(wǎng)膜光損傷后，RPE細(xì)胞結(jié)構(gòu)發(fā)生了重要的病理改變，視網(wǎng)膜光損傷所導(dǎo)致的色素上皮細(xì)胞的凋亡與Caspase-3蛋白酶的激活有著密切的關(guān)系。我們將rhEPO作為一種預(yù)處理因素應(yīng)用到光損傷模型中，觀察發(fā)現(xiàn)EPO可在一定程度上保護(hù)RPE功能，抑制細(xì)胞凋亡，從而對(duì)視網(wǎng)膜光損傷起到治療作用。這與相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道一致［3－6］。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)了Caspase-3誘導(dǎo)視網(wǎng)膜光損傷后的色素上皮細(xì)胞凋亡，同時(shí)觀察發(fā)現(xiàn)EPO可抑制Caspase-3蛋白的表達(dá)，減少色素上皮細(xì)胞的凋亡，推測(cè)這可能是EPO治療視網(wǎng)膜光損傷的作用機(jī)制之一，從而為包括視網(wǎng)膜光損傷疾病在內(nèi)的多種視網(wǎng)膜變性疾病的研究開(kāi)辟了新的治療手段。

［1］孟 巖，牛膺筠，周占宇，等.rhEPO對(duì)光損傷誘導(dǎo)的RPE細(xì)胞凋亡的抑制［J］.中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2007，23(10):1275－9.

［1］Meng Y，Niu Y J，Zhou Z Y，et al.Inhibition of light induced apoptosis of RPE cells by recombinant human erythropoietin［J］.Chin Pharmacol Bull，2007，23(10):1275－9.

［2］王紅云，牛膺筠，王培嵩，等.重組人促紅細(xì)胞生成素對(duì)小鼠視網(wǎng)膜光損傷保護(hù)作用的研究［J］.中華眼科雜志，2005，41:434－8.

［2］Wang H Y，Niu Y J，Wang P S，et al.Erythropoietin administration protects retina against light-induced retinal degeneration［J］.Chin J Ophthalmol，2005，41(10):434－ 8 .

［3］Kawano T，Kato M.Electrophysiologic evaluation of retinal pigment epithelial damage induced by photic exposure［J］.Retina，2003，23(4):513－7.

［4］Becerra S P，Amaral J.Erythropoietin-an endogenous retinal survial factor［J］.N Engl Med，2002，347(24):1968－70.

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［6］Sepodes B，Maio R，Pinto R.Recombinant human erythropoietin protects the liver from hepatic ischemia-reperfusion injury in the rat［J］.Transpl Int，2006，19(11):919－26.