劉國榮， 李平蘭， 王成濤

(1.北京工商大學(xué)食品添加劑與配料北京高校工程研究中心/食品風(fēng)味化學(xué) 北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100048; 2.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院，北京 100083)

乳酸菌細(xì)菌素作為天然生物防腐劑在食品工業(yè)中的應(yīng)用進(jìn)展

劉國榮1，2， 李平蘭2， 王成濤1

(1.北京工商大學(xué)食品添加劑與配料北京高校工程研究中心/食品風(fēng)味化學(xué) 北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100048; 2.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院，北京 100083)

乳酸菌細(xì)菌素是乳酸菌在代謝過程中合成的天然抑菌多肽或蛋白質(zhì)，由于其對食品腐敗菌和致病菌的強(qiáng)烈抑菌活性，已成為天然食品生物防腐劑研究與開發(fā)的熱點(diǎn).對乳酸菌細(xì)菌素在食品工業(yè)中的應(yīng)用研究作了全面系統(tǒng)的綜述，并指出了目前存在的主要問題和今后的研究方向.

乳酸菌細(xì)菌素;天然生物防腐劑;食品工業(yè)

食品在加工和保藏過程中，極易受到微生物污染而導(dǎo)致腐敗變質(zhì)，采用防腐劑抑制微生物，延緩腐敗是當(dāng)今食品保鮮的重要技術(shù)之一.據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，世界上約有20%的糧油食品因霉變、腐敗而被浪費(fèi)掉，同時(shí)它還嚴(yán)重危及了人類健康，如在美國，由沙門氏菌之類的致病菌引發(fā)的食源性疾病每年造成7 000人死亡，2 400萬～8 000萬人的腸胃中毒，直接經(jīng)濟(jì)損失高達(dá)50億～170億美元.因而進(jìn)行食品防腐保鮮是保障食品安全的重要手段［1］.然而，食品中使用最多的是化學(xué)防腐劑，影響人體健康，它的應(yīng)用越來越受到眾多國家的限制.天然生物防腐劑具有安全、無毒、適用性廣、性能穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)，因此，開發(fā)天然食品生物防腐劑已成為現(xiàn)代食品工業(yè)的重要任務(wù).

乳酸菌及其活性代謝產(chǎn)物與人類的健康密切相關(guān)，常常被有意識(shí)地引進(jìn)食品產(chǎn)品或自然地發(fā)生在食品中，從而使食品擁有人們渴望的風(fēng)味、結(jié)構(gòu)、營養(yǎng)及健康的特征.乳酸菌細(xì)菌素是乳酸菌在代謝過程中合成并分泌到環(huán)境中的一類具有抑菌活性的多肽或蛋白類物質(zhì)，它在人體內(nèi)可被降解，具有無毒、無殘留、高效、耐酸、耐高溫、無抗藥性等特點(diǎn)，目前已成為天然防腐劑研究與開發(fā)的熱點(diǎn)［2－3］.

近年來，有許多學(xué)者進(jìn)行了乳酸菌細(xì)菌素在食品、飼料、生物制藥中的應(yīng)用研究，取得了大量的研究成果.本文重點(diǎn)對近年來乳酸菌細(xì)菌素在食品工業(yè)中的應(yīng)用進(jìn)展進(jìn)行了綜述.

1 乳酸菌細(xì)菌素在食品中的應(yīng)用概況

乳酸菌產(chǎn)生的細(xì)菌素具有以下的特點(diǎn)，使得其成為食品天然防腐劑開發(fā)對象.1)細(xì)菌生長繁殖快，生產(chǎn)周期短，適合工業(yè)化生產(chǎn);2)具有較好的穩(wěn)定性，適合食品加工處理，使用方便;3)能被人體內(nèi)的蛋白酶降解，不在體內(nèi)蓄積，不會(huì)對腸道正常菌群有影響;4)不會(huì)產(chǎn)生耐藥性，不會(huì)誘發(fā)食品病原菌等微生物對治療用抗生素的抗性;5)便于利用現(xiàn)代基因工程技術(shù)對細(xì)菌素基因進(jìn)行修飾和改造［4］.

目前，乳酸菌細(xì)菌素作為食品防腐劑在食品中的應(yīng)用方式主要有以下4種.1)直接添加細(xì)菌素到食品中或以細(xì)菌素產(chǎn)生菌作為發(fā)酵劑生產(chǎn)發(fā)酵食品;2)開發(fā)制備包含細(xì)菌素的食品包裝袋或保鮮膜;3)在用于食品發(fā)酵的微生物中表達(dá)外源細(xì)菌素基因;4)基于細(xì)菌素柵欄技術(shù)的應(yīng)用［5］.

2 直接添加乳酸菌細(xì)菌素到食品中

目前，在食品中已經(jīng)廣泛使用的乳酸鏈球菌素(nisin)，正是直接添加乳酸菌細(xì)菌素到食品中這種投放模式的極好例子.而細(xì)菌素產(chǎn)生菌作為發(fā)酵劑或者輔助培養(yǎng)物、保護(hù)性培養(yǎng)物添加到食品中，既可以避免細(xì)菌素較為繁瑣的純化程序，又可以利用乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)生的其他抑菌物質(zhì)來提高細(xì)菌素的抑菌活性，改善產(chǎn)品的品質(zhì)，延長貨架期，也是較為經(jīng)濟(jì)的投放模式.現(xiàn)在許多研究也已證明，產(chǎn)生細(xì)菌素的發(fā)酵劑在發(fā)酵過程中可以防止或抑制不良菌的污染，因而將產(chǎn)細(xì)菌素的乳酸菌加入到食品中比直接添加細(xì)菌素更好.另外，以更易于接受的方式或在較低投入的情況下，將細(xì)菌素或者產(chǎn)生菌作為一種食品成分添加到食品中，如ALTA 2341和FARGO 23(純天然多功能的片球菌發(fā)酵食品成分，含有天然的代謝產(chǎn)物包括有機(jī)酸和片球菌素)［6］.

產(chǎn)細(xì)菌素戊糖乳桿菌31-1，分離自我國傳統(tǒng)發(fā)酵肉制品宣威火腿，其所產(chǎn)細(xì)菌素pentocin 31-1對單增李斯特氏菌(Listeria monocytogene)有強(qiáng)烈抑制效果，且有較好食品加工耐受特性.本課題組前期將pentocin 31-1添加到托盤包裝的冷卻豬肉中，并從微生物、理化指標(biāo)、感官品質(zhì)三個(gè)方面綜合評價(jià)pentocin 31-1對冷卻肉的防腐保鮮效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在冷卻豬肉的儲(chǔ)藏過程中，pentocin 31-1的添加可以明顯延長冷卻肉的貨架期，抑制揮發(fā)性鹽基氮含量升高，降低微生物生長速率，尤其是可以強(qiáng)烈抑制假單胞菌和潛在致病菌李斯特氏菌的生長.并確定添加80 AU/g pentocin 31-1的保鮮效果最好，可將托盤包裝冷卻豬肉的保質(zhì)期延長至15 d，并保持良好的感官特性.這些結(jié)果都顯示了該細(xì)菌素具有作為天然生物防腐劑應(yīng)用于冷卻肉制品中的潛力［7－8］.

在此基礎(chǔ)上，本課題組還探討了產(chǎn)細(xì)菌素戊糖乳桿菌31-1作為發(fā)酵劑菌株在發(fā)酵香腸生產(chǎn)中的工業(yè)適應(yīng)性，以期開發(fā)具有生物防腐功能的新型肉品發(fā)酵劑.對比商業(yè)發(fā)酵劑菌株，利用菌株31-1生產(chǎn)發(fā)酵香腸，可提高乳酸菌競爭優(yōu)勢，加速香腸發(fā)酵;同時(shí)降低有害微生物數(shù)量，增加食品安全.此外，還可顯著提高游離氨基酸和游離脂肪酸的含量，賦予終產(chǎn)品具有很好的感官品質(zhì)和總體可接受性，顯示出了該菌株作為新型功能型發(fā)酵劑生產(chǎn)發(fā)酵香腸的巨大應(yīng)用前景［9］.

3 開發(fā)制備成食品包裝袋或保鮮膜

開發(fā)制備包含乳酸菌細(xì)菌素的食品包裝袋或保鮮膜是近年來國際上較為流行的一個(gè)細(xì)菌素應(yīng)用研究方向，目前國內(nèi)相關(guān)研究幾乎為空白.這種應(yīng)用方式的最大優(yōu)點(diǎn)是可使乳酸菌細(xì)菌素在食品保藏過程緩慢釋放，最大程度延長細(xì)菌素的活性發(fā)揮時(shí)間.已有部分研究學(xué)者通過此方式取得了較為理想的研究成果，如Ercolini等［10］把細(xì)菌素涂布到包裝薄膜上，并對細(xì)菌素的活性進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)其能有效抑制與薄膜直接接觸的、食品表面的李斯特氏菌(Listeria spp.)的生長.Franklin等［11］用含有 nisin的包裝紙包裝熱狗，在60 d的觀察中發(fā)現(xiàn)，熱狗表面李斯特氏菌數(shù)量比普通包裝紙中的明顯降低.Mauriello等［12］用彎曲乳桿菌(L.curvatus)32Y所產(chǎn)細(xì)菌素通過浸泡、噴涂、涂層3種不同的方法處理了塑膠包裝膜.在4℃條件下，用這些薄膜包裝的豬肉、牛排和牛肉表面的李斯特氏菌數(shù)量很少，貨架期明顯延長.Jin等［13］采用含有nisin的聚乳酸材料包裝橙汁和液體蛋清，結(jié)果發(fā)現(xiàn)nisin能夠均勻地分布于聚乳酸表面，并對E.coli O157:H7，L.monocytogene和Salmonella都有較強(qiáng)的抑制作用.這些結(jié)果都說明，運(yùn)用高分子物質(zhì)與細(xì)菌素結(jié)合材料來進(jìn)行食品保藏具有廣闊的前景.

4 基于異源表達(dá)技術(shù)的應(yīng)用

實(shí)際生產(chǎn)中，很多因素會(huì)限制這類細(xì)菌素的有效性，如基因不穩(wěn)定性、抑菌活性的消失、敏感細(xì)胞抗性的出現(xiàn)等.而且并不是所有的工業(yè)微生物都可以產(chǎn)生細(xì)菌素，而產(chǎn)生細(xì)菌素的菌株也并不一定適應(yīng)細(xì)菌素發(fā)揮作用的環(huán)境.因此，近年來有許多學(xué)者嘗試通過將細(xì)菌素基因?qū)氩划a(chǎn)生細(xì)菌素的工業(yè)菌株中而使其獲得細(xì)菌素產(chǎn)生的能力，既可以保證食品質(zhì)量，又可以抑制食品中的腐敗菌和病原菌，提高食品安全性［2，14］.通過異源表達(dá)可以:1)提高細(xì)菌素的產(chǎn)量，以便進(jìn)行細(xì)菌素的作用模式、結(jié)構(gòu)與功能及應(yīng)用性研究;2)減少在目標(biāo)細(xì)胞中細(xì)菌素抗性的發(fā)生，提高其在食品中的抗菌效率;3)在更安全的宿主中生產(chǎn)細(xì)菌素;4)構(gòu)建出對多種不良微生物都有抑菌活性的細(xì)菌素產(chǎn)生菌;5)構(gòu)建出對食品環(huán)境有更好適應(yīng)性的重組宿主;6)為乳酸菌提供更好的抗菌特性，使其在作為食品發(fā)酵劑、益生菌制劑、飼料添加劑等時(shí)能更好地發(fā)揮作用［15］.總之，異源表達(dá)技術(shù)將為乳酸菌細(xì)菌素作為天然生物防腐劑在食品工業(yè)中的應(yīng)用提供嶄新的發(fā)展方向.

目前，可用于乳酸菌細(xì)菌素異源表達(dá)的系統(tǒng)主要有大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)、乳酸菌表達(dá)系統(tǒng)及酵母菌表達(dá)系統(tǒng)，其中大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)的相關(guān)研究最多，但是大腸桿菌菌株本身不具有食品應(yīng)用特性，因此僅表達(dá)產(chǎn)物可用于食品工業(yè)，有一定的局限性.與大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)相比較，食品級(jí)乳酸菌和酵母菌表達(dá)系統(tǒng)獲得相對困難，但是這些菌本身安全且能夠?qū)⒛康牡鞍追置诘桨?，可放心?yīng)用于食品工業(yè)化生產(chǎn)［15－16］.

本課題組前期建立了腸球菌素enterocin P在食品級(jí)乳酸乳球菌中的異源分泌與表達(dá)系統(tǒng)，以nisI作為食品級(jí)選擇標(biāo)記，將enterocin P基因克隆至食品級(jí)表達(dá)載體pLEB590并電轉(zhuǎn)化至乳酸乳球菌MG 1614中，組成型表達(dá)了具有生物抑菌活性的enterocin P，該研究結(jié)果不但拓展了乳酸乳球菌食品級(jí)表達(dá)載體的應(yīng)用范圍，而且為開發(fā)產(chǎn)細(xì)菌素的工業(yè)化發(fā)酵劑、益生菌制劑等奠定了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ).這是國內(nèi)外首次建立enterocin P在乳酸乳球菌中的異源表達(dá)系統(tǒng)，與同類文獻(xiàn)相比，其采用的所有表達(dá)元件均為食品級(jí)［16－18］.目前，正在嘗試將 enterocin P 基因?qū)氩划a(chǎn)細(xì)菌素的發(fā)酵劑乳酸乳球菌菌株中而使其獲得產(chǎn)細(xì)菌素的能力，使其既可發(fā)酵食品，又可抑制食品中的腐敗菌和病原菌.

5 基于柵欄技術(shù)的應(yīng)用

柵欄技術(shù)是將許多不同的防腐保藏技術(shù)聯(lián)合應(yīng)用以抑制微生物的生長.已有研究報(bào)道，兩種不同的乳酸菌細(xì)菌素聯(lián)合使用，或者乳酸菌細(xì)菌素和其他防腐技術(shù)結(jié)合，都可以作為柵欄技術(shù)應(yīng)用于食品加工和貯藏過程中，來有效抑制有微生物引起的食品腐?。?9－20］.如，乳酸菌細(xì)菌素與化學(xué)防腐劑的聯(lián)合使用，既可以提高抗菌活性又可減少化學(xué)防腐劑的使用［6］.目前已報(bào)道可與乳酸菌細(xì)菌素聯(lián)合使用的其他防腐技術(shù)包括:1)化學(xué)防腐劑，如檸檬酸鈉、乳酸鈉、雙乙酸鈉等;2)物理殺菌技術(shù)，如熱處理、冷處理等;3)非熱力殺菌技術(shù)有高壓脈沖電場(pulsed electric field，PEF)、超高壓(high hydrostatic pressure，HHP)、真空包裝等;4)酶制劑，如溶菌酶等;5)金屬螯合劑，如EDTA、三磷酸鈉(sodium tripolyphosphate，STPP);6)其他，如月桂酸甘油酯等.這些技術(shù)與乳酸菌細(xì)菌素聯(lián)合使用可以增加細(xì)胞膜的通透性從而增強(qiáng)細(xì)菌素的抑菌效果.革蘭氏陰性菌通常對乳酸菌細(xì)菌素不敏感，而當(dāng)乳酸菌細(xì)菌素與金屬螯合劑或物理殺菌技術(shù)聯(lián)合使用時(shí)，可以破壞革蘭氏陰性菌的細(xì)胞膜，使細(xì)菌素更容易進(jìn)入細(xì)胞并發(fā)揮其抑菌作用，大大提高細(xì)菌素抑菌效果［3］.除此之外，這些技術(shù)的有效組合還可大大減少乳酸菌細(xì)菌素耐受菌株的出現(xiàn)，并最大程度地保持食品良好的感官特性.表1為乳酸菌細(xì)菌素在柵欄技術(shù)中應(yīng)用的成功例子.

表1 乳酸菌細(xì)菌素在柵欄技術(shù)中的應(yīng)用Tab.1 Application of bacteriocins as a part of hurdle technology to control pathogen and spoiling microbiorganisms in foods

續(xù)表1

乳酸菌細(xì)菌素由于其高效、安全、無毒、可被人體消化等優(yōu)點(diǎn)，使其成為天然生物防腐劑的研究熱點(diǎn)，但是它們只對革蘭氏陽性菌有非常強(qiáng)烈的抑制作用，而對革蘭氏陰性菌幾乎沒有抑制作用或抑制作用很弱.超高壓處理(HHP)是目前比較流行的非熱力殺菌技術(shù)，但是有研究報(bào)道，當(dāng)HHP壓力在600 MPa以上時(shí)，不僅會(huì)一定程度上加速產(chǎn)品脂肪氧化、影響食品的感官特性;而且會(huì)加快超高壓設(shè)備磨損、增加設(shè)備的制作和使用成本，制約HHP的商業(yè)應(yīng)用推廣［35－36，38］.為了在較低超高壓壓力下仍獲得較強(qiáng)的殺菌效果并增強(qiáng)乳酸菌細(xì)菌素對革蘭氏陰性細(xì)菌的抑菌作用，本課題組前期研究中將細(xì)菌素和超高壓技術(shù)聯(lián)合使用并考察其對低溫切片火腿的防腐保鮮效果.通過此方法，一方面可以降低超高壓的施壓壓力，另一方面可以通過HHP增加革蘭氏陰性菌的細(xì)胞膜滲透性，從而增強(qiáng)細(xì)菌素對其的抑制效果.研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在不添加任何化學(xué)防腐劑的情況下，enterocin P和超高壓技術(shù)的聯(lián)合使用可明顯延長低溫切片火腿的貨架期，有效減少貯藏過程中揮發(fā)性鹽基氮的生成及脂肪氧化，并保持產(chǎn)品原有色澤、氣味、質(zhì)構(gòu)等感官特性.綜合微生物、理化及感官特性分析，確定添加2 560 AU/g enterocin P，且經(jīng)400 MPa超高壓處理10 min的處理效果最好，可將產(chǎn)品貨架期延長到90 d以上［37，16］.該研究結(jié)果預(yù)示乳酸菌細(xì)菌素和超高壓聯(lián)合處理在低溫肉制品防腐保鮮中有巨大應(yīng)用前景.

6 小結(jié)與展望

從乳酸菌細(xì)菌素的應(yīng)用現(xiàn)狀可以看出，制約其在食品工業(yè)中開發(fā)與應(yīng)用的主要因素有:1)天然合成細(xì)菌素的產(chǎn)量過低，而且有些細(xì)菌素基因由質(zhì)粒編碼，產(chǎn)量不穩(wěn)定;2)提取過程繁瑣，高純度細(xì)菌素制品的制備困難;3)除nisin外，其他新型細(xì)菌素缺少安全性評價(jià)認(rèn)證.除需解決以上瓶頸外，未來還可以進(jìn)行以下幾個(gè)方面的探索研究.

6.1 具體食品環(huán)境對乳酸菌細(xì)菌素抑菌效果的影響

由于食品基質(zhì)和環(huán)境，以及其他物質(zhì)等因素都可能會(huì)對乳酸菌細(xì)菌素防腐效果產(chǎn)生影響，因此，有待進(jìn)一步系統(tǒng)地研究食品基質(zhì)和理化環(huán)境、微生物菌群以及其他添加物質(zhì)等對乳酸菌細(xì)菌素抑菌效果的影響，為將來乳酸菌細(xì)菌素作為新型生物防腐劑用于食品防腐保鮮奠定基礎(chǔ).

6.2 乳酸菌細(xì)菌素與其他防腐技術(shù)的協(xié)同作用機(jī)制

很多研究結(jié)果已經(jīng)發(fā)現(xiàn)乳酸菌細(xì)菌素與其他一些防腐技術(shù)如HHP等存在協(xié)同作用現(xiàn)象，但是它們之間的作用機(jī)制還不清楚，有待于進(jìn)一步研究.

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(責(zé)任編輯:王 寬)

Advances on Application of Bacteriocins Produced by Lactic Acid Bacteria as Natural Bio-preservative in Food Industry

LIU Guo-rong1，2， LI Ping-lan2， WANG Cheng-tao1
(1.Beijing Higher Institution Engineering Research Center of Food Additives and Ingredients/Beijing Key Laboratory of Flavor Chemistry，Beijing Technology and Business University，Beijing 100048，China;2.College of Food Science and Nutritional Engineering，China Agricultural University，Beijing 100083，China)

Bacteriocins were antibacterial activity protein or peptide produced by lactic acid bacteria，and they were identified with great potential as natural food bio-preservative because of their strongly antibacterial activity against food borne pathogens and spoilage organism.In this review，the development of the application of bacteriocin as preservative in food industry was reviewed.The existing problems and future research consideration were pointed out.

bacteriocins;natural bio-preservative;food industry

TS201.6

A

1671-1513(2012)02-0064-06

2011-11-04

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(30671482);北京市教委科技面上項(xiàng)目(KM201110011001);北京工商大學(xué)青年教師科研啟動(dòng)基金項(xiàng)目(QNJJ2011-042).

劉國榮，女，講師，博士，主要從事食品微生物學(xué)方面的研究;

李平蘭，女，教授，博士，主要從事乳酸菌及其活性代謝產(chǎn)物方面的研究.通訊作者.