蔡要欣，張韌錚，孫 嵐，宋東穎，劉貴富，張莉蓉#，張英鴿#

1)軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院毒物藥物研究所 北京 100850 2)鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室鄭州 450001 3)吉林大學(xué)藥學(xué)院長春 130021 4)中國人民解放軍66018部隊衛(wèi)生隊北京 100144

#通訊作者，張英鴿，男，1958年10月生，博士，教授，研究方向:納米藥理，E-mail:zhangyg58@126.com;張莉蓉，女，1964年10月生，博士，教授，研究方向:遺傳藥理，E-mail:lrzhang@zzu.edu.cn

納米活性炭吸附多烯紫杉醇對A549細(xì)胞增殖及凋亡的影響*

蔡要欣1，2)，張韌錚2)，孫 嵐1)，宋東穎1，3)，劉貴富4)，張莉蓉2)#，張英鴿1)#

1)軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院毒物藥物研究所 北京 100850 2)鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室鄭州 450001 3)吉林大學(xué)藥學(xué)院長春 130021 4)中國人民解放軍66018部隊衛(wèi)生隊北京 100144

#通訊作者，張英鴿，男，1958年10月生，博士，教授，研究方向:納米藥理，E-mail:zhangyg58@126.com;張莉蓉，女，1964年10月生，博士，教授，研究方向:遺傳藥理，E-mail:lrzhang@zzu.edu.cn

納米活性炭;多烯紫杉醇;A549細(xì)胞;凋亡;增殖

目的:研究納米活性炭吸附多烯紫杉醇(ACNP-DOC)對人肺腺癌細(xì)胞A549增殖及凋亡的影響。方法:將A549細(xì)胞分別用0.2、1.0、5.0、25.0和125.0 μmol/L DOC和ACNP-DOC培養(yǎng)12、24、48和72 h后，MTT法測細(xì)胞增殖抑制率。將A549分別用IC50濃度的ACNP-DOC、DOC和與ACNP-DOC等量的ACNP培養(yǎng)24 h后，應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。結(jié)果:0.2～125.0 μmol/L的DOC及ACNP-DOC對A549細(xì)胞均有增殖抑制作用，作用呈濃度和時間依賴性，ACNP-DOC組細(xì)胞增殖抑制率高于DOC組(F藥物=12.326，F(xiàn)時間=76.247，F(xiàn)濃度=53.028，F(xiàn)交互=20.842，P＜0.05)。ACNP-DOC的IC50為0.80 μmol/L，DOC為43.45 μmol/L。ACNP、DOC和ACNP-DOC組的細(xì)胞總凋亡率差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=30.208，P＜0.001)，ACNP-DOC組凋亡率高于ACNP組和DOC組(P均＜0.001)。結(jié)論:ACNP-DOC較DOC對A549細(xì)胞有較強的增殖抑制及誘導(dǎo)凋亡作用。

肺癌是一種嚴(yán)重影響人類健康的疾病。近年來，多烯紫杉醇(docetaxel，DOC)已成為臨床上治療肺癌、乳癌等一些實體瘤的一線藥物，但由于DOC選擇性低、復(fù)發(fā)率高，且治療指數(shù)低、毒副作用高，患者常不能忍受化療的痛苦。有文獻報道［1］，在生物體內(nèi)，與傳統(tǒng)藥物制劑相比，以納米活性炭(activated carbon nanoparticles，ACNP)為藥物載體的制劑表現(xiàn)出明顯的優(yōu)勢，它所攜帶的藥物具有緩控釋作用，使游離藥物濃度長時間維持在治療窗，并可提高局部組織藥物的濃度［2-5］。作者觀察了納米活性炭吸附多烯紫杉醇(ACNP-DOC)對人肺腺癌A549細(xì)胞增殖和凋亡的影響，為其臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 高糖DMEM培養(yǎng)液(Hyclone公司)，胎牛血清(Gibco公司)，胰蛋白酶和DMSO(Amresco公司)，MTT(ACROS公司)，DOC(北京偶合科技有限公司)，ACNP、ACNP-DOC均為國家納米中心協(xié)作實驗室自制，細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(寶賽生物技術(shù)有限公司)。A549細(xì)胞株由國家納米中心協(xié)作實驗室凍存。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) A549細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)于含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的高糖DMEM完全培養(yǎng)基中，并于37℃、95%濕度、含體積分?jǐn)?shù)5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，3～4 d傳代1次，取對數(shù)生長期細(xì)胞進行實驗。

1.3 ACNP-DOC對A549細(xì)胞增殖影響的觀察將處于對數(shù)生長期的A549細(xì)胞，用2.5 g/L的胰蛋白酶消化，加入適量新鮮含有體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的高糖DMEM完全培養(yǎng)基，用吹打管吹打成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為1.5×105mL－1，按100 μL/孔接種于96孔板中，然后分別用0.2、1.0、5.0、25.0和125.0 μmol/L DOC和ACNP-DOC培養(yǎng)，每個濃度設(shè)5個復(fù)孔，每孔加藥50 μL。培養(yǎng)12、24、48和72 h后，MTT法測細(xì)胞增殖抑制率，檢測波長為490 nm。取復(fù)孔平均光密度(OD)值為結(jié)果，細(xì)胞增殖抑制率=(對照組OD值－實驗組OD值)/對照組OD值×100%。實驗重復(fù)5次。

1.4 ACNP-DOC對A549細(xì)胞凋亡影響的觀察將A549接種于50 mL培養(yǎng)瓶中，至細(xì)胞豐度約達(dá)80%時，隨機分成3組，每組2瓶，分別加入IC50濃度的ACNP-DOC、DOC和與ACNP-DOC等量的ACNP后繼續(xù)培養(yǎng)24 h，然后用2.5 g/L胰蛋白酶消化，經(jīng)吹打、收集，調(diào)細(xì)胞密度為(0.5～1.0)×106mL－1，1 000 r/min離心10 min(4℃)，PBS(4℃)洗2次后，棄上清。細(xì)胞分別重懸于200 μL Binding Buffer和10 μL Annexin V-FITC中，室溫避光反應(yīng)15 min，加入300 μL Binding Buffer，總反應(yīng)體積不少于500 μL，上機前5 min加入50 μL PI避光反應(yīng)后，上流式儀檢測凋亡率。實驗重復(fù)3次

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 17.0進行分析，采用2×5×4析因設(shè)計的方差分析評估DOC及ACNPDOC對A549細(xì)胞增殖的影響，3組間細(xì)胞總凋亡率的比較應(yīng)用單因素方差分析及LSD-t檢驗，檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 ACNP-DOC對A549細(xì)胞增殖的影響 經(jīng)不同濃度DOC及ACNP-DOC作用不同時間后，A549細(xì)胞增殖測定結(jié)果見表1。DOC及ACNP-DOC對A549細(xì)胞均有增殖抑制作用，ACNP-DOC較DOC明顯。ACNP-DOC的IC50為0.80 μmol/L，DOC為43.45 μmol/L。

2.2 ACNP-DOC對A549細(xì)胞凋亡的影響 ACNP、DOC和 ACNP-DOC組的總凋亡率分別為(5.73±2.08)%、(12.89±1.94)%和(27.95± 3.04)%，3組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F= 30.208，P＜0.001)，ACNP-DOC組凋亡率高于ACNP組和DOC組(P均＜0.001)。

表1 不同濃度DOC及ACNP-DOC作用12、24、48和72 h后A549細(xì)胞的增殖抑制率(n=5)

3 討論

DOC是新一代半合成紫杉醇類抗癌藥物，屬于細(xì)胞周期特異性藥，作用于M期，能促進微管蛋白裝配成微管和抑制微管解聚，從而導(dǎo)致穩(wěn)定的非功能性微管束的形成，使紡錘體失去正常功能，致使癌細(xì)胞死亡，具有較高的抗腫瘤活性。然而傳統(tǒng)的DOC抗癌化療方法具有低選擇性、高毒性及嚴(yán)重耐藥等缺點，如果通過使用載體將DOC選擇性地輸送到肺癌組織周圍而不輸送到或很少輸送到正常組織和器官，且能較長時間在肺癌周圍保持一定的藥物濃度，將可以提高療效，并改善患者的生存質(zhì)量。

由于具有蜂窩狀多孔結(jié)構(gòu)，ACNP具有良好的吸附性能，但ACNP與被吸附藥物之間并沒有形成牢固的共價鍵，所以當(dāng)游離藥物濃度降低時被吸附的藥物可以從ACNP介孔表面解離出來，再次變成游離的藥物。ACNP顆粒的粒徑越小，比表面積就越大，吸附能力也就越強［6-7］。故作者選用ACNP作為DOC的吸附載體。實驗中選用A549細(xì)胞作為受試細(xì)胞，因為該細(xì)胞易于培養(yǎng)，比較適用于納米材料的體外細(xì)胞毒性作用研究［8-10］。

實驗結(jié)果顯示，ACNP-DOC及DOC在0.2～125.0 μmol/L濃度范圍作用12、24、48和72 h后均可抑制A549細(xì)胞的增殖，并且隨著藥物濃度的增高及作用時間的延長，抑制作用也增強，抑制率與藥物濃度和作用時間之間均成量效關(guān)系;結(jié)果也顯示ACNP-DOC較DOC抑制A549細(xì)胞的增殖效果更明顯。

細(xì)胞凋亡是一種由基因控制的、主動的程序化細(xì)胞死亡過程，是維持器官組織細(xì)胞數(shù)量穩(wěn)定和內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的重要機制［11］，是在基因控制下的細(xì)胞自我消亡過程;促進細(xì)胞凋亡將有助于徹底治愈腫瘤［12-13］。該研究結(jié)果顯示，ACNP-DOC和DOC均可促進A549細(xì)胞的凋亡，且ACNP-DOC的作用強于DOC。

綜上所述，ACNP-DOC較DOC對A549細(xì)胞有更強的增殖抑制及誘導(dǎo)凋亡作用，ACNP-DOC可能較傳統(tǒng)的DOC給藥方法具有更好的抗腫瘤效用。

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Effects of docetaxel-loaded activated carbon nanoparticles on proliferation and apoptosis of A549 cells

CAI Yaoxin1，2)，ZHANG Renzheng2)，SUN Lan1)，SONG Dongying1，3)，LIU Guifu4)，ZHANG Lirong2)，ZHANG Yingge1)1)Institute of Pharmacology and Toxicology，Academy of Military Medical Sciences，Beijing 1008502)Department of Pharmacology，College of Basic Medical Sciences，Zhengzhou University，Zhengzhou 450001 3)College of Pharmacy，Jilin University，Changchun 130021 4)Chinese People’s Liberation Army 66018 Military Health Team，Beijing 100144

activated carbon nanoparticle;docetaxel;A549 cell;apoptosis;proliferation

Aim:To study the effects of docetaxel(DOC)-loaded activated carbon nanoparticles(ACNP-DOC)on proliferation and apoptosis of human lung cancer A549 cells.Methods:A549 cells were teated with 0.2，1.0，5.0，25.0 and 125.0 μmol/L DOC or ACNP-DOC for 12，24，48 and 72 h，respectively，then the proliferation inhibition rate was assayed by MTT.A549 cells were teated with ACNP-DOC，DOC and ACNP at dose of IC50for 24 h，then the apoptosis rate was detected by flow cytometry.Results:DOC and ACNP-DOC in the concentration range of 0.2～125.0 μmol/L could inhibit A549 cell proliferation in a time-and concentration-dependent manner，but the effects of ACNP-DOC were significantly stronger(Fdrug=12.326，F(xiàn)time=76.247，F(xiàn)dose=53.028，F(xiàn)interaction=20.842，P＜0.05).IC50of ACNP-DOC and DOC was 0.80 and 43.45 μmol/L，respectively.The apoptosis rate of A549 cells treated with ACNP，DOC，or ACNP-DOC at the dose of IC50differed from each other(F=30.208，P＜0.001)，and that of ACNP-DOC group was higher than those of ACNP group and DOC group(P＜0.001).Conclusion:ACNP-DOC can inhibit A549 cell proliferation，induce apoptosis，and the effects is stronger than DOC.

R734.2

10.3969/j.issn.1671-6825.2012.06.004

*國家863計劃項目 2006AA03Z333;國家973計劃項目 2010CD933904

(2012-02-15收稿 責(zé)任編輯王 曼)