單 磊，郝建偉，王向陽

河南省人民醫(yī)院泌尿外科鄭州 450003

#通訊作者，男，1974年7月生，博士，主治醫(yī)師，研究方向:泌尿系腫瘤，E-mail:exwhao@126.com

LNCaP凍融抗原致敏的樹突狀細(xì)胞誘導(dǎo)的CTL對(duì)LNCaP細(xì)胞的殺傷作用*

單 磊，郝建偉#，王向陽

河南省人民醫(yī)院泌尿外科鄭州 450003

#通訊作者，男，1974年7月生，博士，主治醫(yī)師，研究方向:泌尿系腫瘤，E-mail:exwhao@126.com

樹突狀細(xì)胞;前列腺癌;免疫治療

目的:研究負(fù)載LNCaP凍融抗原的樹突狀細(xì)胞(DC)誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)對(duì)前列腺癌LNCaP細(xì)胞的殺傷效應(yīng)。方法:采用反復(fù)凍融法獲得LNCaP細(xì)胞抗原，聯(lián)合應(yīng)用rhIL-4、rhGM-CSF和TNF-α體外誘導(dǎo)人外周血單個(gè)核細(xì)胞為成熟DC，并用LNCaP細(xì)胞凍融抗原致敏，用該致敏DC體外誘導(dǎo)CTL，觀察CTL對(duì)LNCaP細(xì)胞的特異性殺傷作用，并采用ELISA法檢測致敏DC IL-12 p70的分泌量。以未致敏DC為對(duì)照。結(jié)果:凍融抗原致敏DC誘導(dǎo)的CTL對(duì)LNCaP細(xì)胞具較高殺傷率，該作用強(qiáng)于未致敏DC，且當(dāng)效靶比為20∶1時(shí)效用最顯著(F組別=68.314，F(xiàn)效靶比=7.251，F(xiàn)交互=56.233，P＜0.05);與未致敏DC相比，致敏DC IL-12 p70分泌量顯著增加(t=4.020，P=0.002)。結(jié)論:LNCaP凍融抗原致敏DC激活的CTL在體外具有更強(qiáng)的殺傷LNCaP細(xì)胞的作用。

前列腺癌是男性泌尿生殖系最常見的惡性腫瘤之一［1］，目前對(duì)晚期前列腺癌仍沒有有效的治療方法，但免疫治療已逐漸受到人們的重視。樹突狀細(xì)胞(dendritic cell，DC)是功能最強(qiáng)的專職抗原呈遞細(xì)胞。在體外制備負(fù)載腫瘤抗原的特異性DC腫瘤疫苗，再注射回體內(nèi)，激發(fā)機(jī)體產(chǎn)生主動(dòng)性抗腫瘤免疫反應(yīng)，是具有良好前景的腫瘤生物治療方案。作者用外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)誘導(dǎo)DC并負(fù)載LNCaP凍融抗原，用其刺激淋巴細(xì)胞，獲得特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(cytotoxic T lymphocytes，CTL)，觀察該效應(yīng)細(xì)胞對(duì)前列腺癌LNCaP細(xì)胞活性的影響，報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 人外周血標(biāo)本取自該院健康志愿者，年齡20～35歲，均在獻(xiàn)血后2 h內(nèi)進(jìn)行PBMC的分離。人前列腺癌細(xì)胞株LNCaP為該科室保存。胎牛血清及RPMI 1640培養(yǎng)液均為美國Gibco公司產(chǎn)品。Ficoll分離液購自上海試劑二廠。rhIL-4、rh-GM-CSF及rhTNF-α購自Peprotech EC公司。MTT試劑盒購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司。ELISA試劑盒為美國R＆D公司產(chǎn)品。Bradford蛋白濃度測定試劑盒為TPI公司產(chǎn)品。

1.2 LNCaP細(xì)胞凍融抗原的制備 常規(guī)培養(yǎng)并收集對(duì)數(shù)生長期LNCaP細(xì)胞，用PBS調(diào)整密度為2× 106mL－1，于－80℃放置20 min，迅速于37℃放置10 min，反復(fù)凍融3次。經(jīng)微孔濾膜過濾后即得可溶性LNCaP凍融抗原，按Bradford蛋白濃度測定試劑盒說明書所示方法測量、計(jì)算抗原的蛋白濃度，－20℃ 保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 DC和T淋巴細(xì)胞的制備 取肝素抗凝的HLA-A2陽性健康志愿者外周血 50 mL，F(xiàn)icoll-Hypaque密度梯度分離，制成PBMC懸液。調(diào)整細(xì)胞密度為2×106mL－1，在37℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2條件下培養(yǎng)2 h。收集上清液，加入IL-2(200 kU/ L)，37℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2條件下培養(yǎng)3 d收集、純化T淋巴細(xì)胞。取貼壁細(xì)胞，加入50 μg/L rhIL-4、100 μg/L rhGM-CSF和體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清，隔日更換培養(yǎng)基并加入細(xì)胞因子，第5日起加入100 μg/L TNF-α，第9天收獲細(xì)胞進(jìn)行DC形態(tài)學(xué)鑒定、細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)。

1.4 LNCaP凍融抗原對(duì)DC的致敏 收集上述DC，以1×106mL－1接種于6孔板中，以DC與抗原(以凍融前腫瘤細(xì)胞的量計(jì))的比例1∶3加入LNCaP凍融抗原，于37℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2條件下過夜培養(yǎng)。

1.5 致敏DC誘導(dǎo)的CTL對(duì)LNCaP細(xì)胞的殺傷效應(yīng) 收集致敏DC，與培養(yǎng)3 d的T細(xì)胞按50∶1的比例混合后于37℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)24 h，所獲細(xì)胞即為CTL。分別以CTL、未負(fù)載凍融抗原的DC誘導(dǎo)的T細(xì)胞和IL-2誘導(dǎo)的T細(xì)胞為效應(yīng)細(xì)胞，以LNCaP細(xì)胞為靶細(xì)胞，按效靶比20∶1、10∶1和1∶1共培養(yǎng)12 h，然后采用MTT法檢測細(xì)胞活性，酶標(biāo)檢測儀檢測波長570 nm處的吸光度(A)值，按公式計(jì)算細(xì)胞殺傷率:殺傷率=(靶細(xì)胞A值－效應(yīng)細(xì)胞A值)/靶細(xì)胞A值×100%。

1.6 DC的IL-12 p70分泌量的測定 分別收集致敏DC和未致敏DC，每組細(xì)胞設(shè)3個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)9 d后收集上清液100 μL，進(jìn)行IL-12 p70檢測，按IL-12 p70 ELISA檢測試劑盒使用說明進(jìn)行操作。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 11.5進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，采用析因設(shè)計(jì)的方差分析評(píng)估致敏DC誘導(dǎo)的CTL對(duì)LNCaP細(xì)胞的殺傷率，應(yīng)用成組設(shè)計(jì)t檢驗(yàn)比較致敏和未致敏DC IL-12 p70分泌量的差異，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 DC的形態(tài)學(xué)觀察 PBMC懸液培養(yǎng)3 h后收獲黏附細(xì)胞，加入細(xì)胞因子培養(yǎng)3 d后可見貼壁細(xì)胞有明顯的集落形成，同時(shí)懸浮細(xì)胞增多，體積增大，細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則;隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，懸浮細(xì)胞逐漸增多，體積增大更明顯，細(xì)胞具有不規(guī)則細(xì)胞核并且胞膜可見毛刺狀或根須狀突起;第9天時(shí)，細(xì)胞體積進(jìn)一步增大，毛刺狀突起增多，并且細(xì)胞多數(shù)呈集束樣懸浮或散在生長，呈多邊形，具有典型的分葉型細(xì)胞核和長的突起(圖1)。

圖1 成熟DC的表現(xiàn)(電子顯微鏡，×3 360)

2.2 致敏DC誘導(dǎo)的CTL對(duì)LNCaP細(xì)胞的殺傷效應(yīng) LNCaP凍融抗原致敏DC誘導(dǎo)的CTL對(duì)LNCaP細(xì)胞具有較高的特異性殺傷效應(yīng)，不同效靶比時(shí)的殺傷率見表1，可以看出，當(dāng)效靶比為20∶1時(shí)CTL對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷效應(yīng)最為明顯。2.3 DC的IL-12 p70分泌量 致敏DC的IL-12 p70分泌量為(85.5±6.4)ng/L，未致敏DC分泌量為(63.4±5.5)ng/L，2者比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=4.020，P=0.002)。

表1 DC誘導(dǎo)的CTL對(duì)LNCaP細(xì)胞的殺傷率(n=3)

3 討論

DC能顯著刺激初始型T細(xì)胞增殖，在機(jī)體抗腫瘤的作用中起關(guān)鍵的始動(dòng)作用［2］。非成熟的DC捕獲抗原后分化為成熟DC，并將抗原肽遞呈給T淋巴細(xì)胞，誘導(dǎo)產(chǎn)生CTL，促進(jìn)CTL分泌細(xì)胞因子(如IL-12、IFN-γ)，產(chǎn)生Th1型免疫應(yīng)答，發(fā)揮抗腫瘤作用［3］。在荷瘤患者體內(nèi)存在抗原呈遞細(xì)胞數(shù)量不足和功能低下，以及腫瘤相關(guān)抗原性弱或具有抗原調(diào)變現(xiàn)象，這兩個(gè)重要原因均可導(dǎo)致機(jī)體無法識(shí)別和遞呈腫瘤抗原，不能激發(fā)有效的CTL抗腫瘤免疫反應(yīng)，使腫瘤細(xì)胞逃避機(jī)體的免疫監(jiān)視，導(dǎo)致腫瘤的形成和發(fā)展［4］。研究［5］表明，前列腺癌細(xì)胞可抑制DC的產(chǎn)生和成熟，并且前列腺癌組織中DC凋亡增加，致使DC減少。目前，體外培養(yǎng)、誘導(dǎo)DC的技術(shù)已基本成熟，但因前列腺癌特異性抗原較少，而由少部分已知的前列腺癌抗原制成的腫瘤疫苗產(chǎn)生的抗腫瘤效果仍不理想［6］。因此，負(fù)載瘤細(xì)胞全部抗原信息的疫苗成為研究熱點(diǎn)。

該實(shí)驗(yàn)中，作者采用凍融的LNCaP細(xì)胞裂解物致敏DC，該方法無需分離鑒定腫瘤的特異性抗原，由DC完成對(duì)瘤細(xì)胞全部抗原的識(shí)別、攝取、加工及遞呈，并且可能激發(fā)多個(gè)腫瘤相關(guān)抗原的T細(xì)胞免疫反應(yīng)，不僅簡便易行，還可增強(qiáng)抗腫瘤作用。細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，由LNCaP凍融抗原致敏DC誘導(dǎo)的CTL比未致敏DC誘導(dǎo)的T淋巴細(xì)胞能更明顯地殺傷LNCaP細(xì)胞，一方面間接說明前列腺癌LNCaP細(xì)胞凍融抗原能促進(jìn)DC的成熟，另一方面也證實(shí)負(fù)載凍融抗原DC激活的CTL在體外能有效殺傷LNCaP細(xì)胞。

IL-12可由B細(xì)胞、肥大細(xì)胞、中性粒細(xì)胞產(chǎn)生，但主要來源于DC的分泌。IL-12 p70可作為DC功能成熟的指標(biāo)，其具有增強(qiáng)DC呈遞抗原、活化T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生抗原特異性免疫應(yīng)答的能力［7］。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，負(fù)載腫瘤抗原DC的IL-12 p70分泌量明顯高于未負(fù)載抗原DC，說明LNCaP凍融抗原可以作為刺激信號(hào)上調(diào)DC分泌IL-12 p70的水平，促進(jìn)DC的功能成熟。

綜上所述，負(fù)載前列腺癌細(xì)胞凍融抗原的DC具有很強(qiáng)的抗原遞呈作用，這種DC瘤苗可有效誘導(dǎo)特異性CTL，產(chǎn)生高效抗腫瘤效應(yīng)，這為DC瘤苗用于治療前列腺癌及預(yù)防前列腺癌術(shù)后轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)提供了理論依據(jù)。

［1］Jemal A，Siegel R，Ward E，et al.Cancer statistics，2009［J］.CA Cancer J Clin，2009，59(4):225

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［4］葉楓，陳懷增，謝幸，等.卵巢癌細(xì)胞株凍融抗原負(fù)載的樹突狀細(xì)胞誘導(dǎo)CTL抗卵巢癌免疫應(yīng)答的體外研究［J］.中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志，2004，24(12):964

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Effects of cytotoxicity T lymphocyte activated by dendritic cell loaded with LNCaP cell line frozen-thawing antigen on LNCaP cell

SHAN Lei，HAO Jianwei，WANG XiangyangDepartment of Urology，Henan Provincial People’s Hospital，Zhengzhou 450003

dendritic cell;prostate cancer;immunotherapy

Aim:To investigate the immune responses of cytotoxic T lymphocytes(CTL)against prostate cancer cell LNCaP after activated by dendritic cell(DC)loaded with LNCaP frozen-thawing antigen in vitro.Methods:LNCaP cells were frozen and melt repeatedly 3 times，then tumor lysate was obtained.After separated from heparinized venous blood of healthy donors by Ficoll-Hypaque density-gradient centrifugation，peripheral blood mononuclear cells(PBMCs)were cultured and induced by rhIL-4 and rhGM-CSF and TNF-α to differentiate into DC.The cytotoxicity of CTL activated by DCs loaded with frozen-thawing antigen and cytokine release were measured by MTT assay and ELISA.Results:DCs could be harvested through healthy donors’PBMCs cultured in vitro.CTL activated by lysate-loaded DCs had more evident cytotoxicity against LNCaP cells in vitro(Fgroup=68.314，F(xiàn)ratio=7.251，F(xiàn)interaction=56.233，P＜0.05).The level of DCs excreting IL-12，which sensitized by LNCaP lysate，was higher than that of unsensitized DCs(t=4.020，P=0.002).Conclusion: CTL activated by DCs loaded with LNCaP frozen-thawing antigen exerts a remarkable killing activity on LNCaP cell in vitro.

R737.25

10.3969/j.issn.1671-6825.2012.06.023

*河南省衛(wèi)生廳科技攻關(guān)基金資助項(xiàng)目 200903134

(2012-12-05收稿 責(zé)任編輯王 曼)