李咪，許嘉瑋，鄒穎，郭家松

南方醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院組織胚胎學(xué)教研室，廣州 510515

樹(shù)突是神經(jīng)元的重要結(jié)構(gòu)，軀體運(yùn)動(dòng)神經(jīng)信號(hào)傳導(dǎo)需要大腦上運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元發(fā)出的指令傳達(dá)至周圍神經(jīng)以支配靶器官，脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元樹(shù)突在該過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。周圍神經(jīng)損傷先導(dǎo)致?lián)p傷處軸突斷裂及遠(yuǎn)端軸突退變，而后會(huì)導(dǎo)致對(duì)應(yīng)脊髓節(jié)段內(nèi)的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元樹(shù)突退變與回縮[1,2]。樹(shù)突退變意味著大腦皮層上運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元發(fā)出的軸突終末失去突觸后成分，此現(xiàn)象稱為“突觸剝離”[3]，是運(yùn)動(dòng)功能障礙的重要原因。長(zhǎng)久以來(lái)，對(duì)周圍神經(jīng)損傷的研究幾乎集中于損傷區(qū)的軸突[4,5]。然而，即便采取措施促進(jìn)軸突再生，甚至實(shí)現(xiàn)了靶區(qū)肌組織神經(jīng)的良好再支配，患者的運(yùn)動(dòng)功能也很難恢復(fù)到正常水平，這說(shuō)明除軸突以外運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元樹(shù)突的退化也不可忽視。Ruijs 等[6]基于23項(xiàng)臨床報(bào)道統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，僅有51.6%的尺神經(jīng)或正中神經(jīng)損傷患者運(yùn)動(dòng)功能修復(fù)滿意。目前對(duì)于周圍神經(jīng)損傷后運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元樹(shù)突變化的研究甚少，現(xiàn)有的結(jié)果僅驗(yàn)證了軸突損傷導(dǎo)致運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)改變[7]和樹(shù)突退化[2,8,9]，而樹(shù)突發(fā)生退變的過(guò)程和形態(tài)變化規(guī)律，以及不同距離損傷對(duì)樹(shù)突退化的影響等未見(jiàn)報(bào)道。本研究采用小鼠臂叢離斷模型，通過(guò)MAP2 免疫熒光和體視學(xué)分析，以及Golgi-Cox 染色和Sholl 分析等方法，探究臂叢離斷后運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元樹(shù)突結(jié)構(gòu)和形態(tài)退變的過(guò)程與規(guī)律，期為周圍神經(jīng)修復(fù)提供形態(tài)學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與主要材料

選用C57BL/6 小鼠，不分性別，8 周齡，體重20～30 g，南方醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心提供。主要試劑包括兔抗MAP2 單克隆抗體（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen）；Alexa Fluor 568 山羊抗兔熒光標(biāo)記抗體（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen）；Golgi-Cox 染色Kit（Hitobiotec）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 造模 小鼠腹腔注射三溴乙醇（12.5 g/mL，0.2 mL/10 g 體重）進(jìn)行麻醉，暴露和鈍性分離右側(cè)臂叢，在距離椎間孔3 mm 或10 mm 處剪斷所有的臂叢分支。左側(cè)臂叢只進(jìn)行暴露和鈍性分離（標(biāo)注為contralateral 組）。

1.2.2 組織收集 術(shù)后7、14、28、56 d，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)取10 只小鼠，其中5 只用于免疫熒光染色，小鼠以三溴乙醇麻醉，經(jīng)心灌注生理鹽水和4%多聚甲醛（PFA），取脊髓C6～7節(jié)段浸泡于4%多聚甲醛內(nèi)；另5 只用于Golgi-Cox 染色，小鼠麻醉后快速斷頭，取出脊髓C6～7節(jié)段用ddH2O 洗凈血液后立刻放入Golgi-Cox 染色Kit 中的溶液1，2 混合液中（比例為1 液：2 液＝1：1，該混合液需提前24 h 混勻備用），脊髓避光浸泡14 d后更換為溶液3 繼續(xù)浸泡5 d 備用。

1.2.3 免疫熒光染色 經(jīng)4% PFA 固定的脊髓以30%蔗糖脫水過(guò)夜，利用冰凍切片機(jī)（Leica）制備脊髓橫切片（厚度為10 μm）。切片用0.01 mol/L 磷酸鹽緩沖液（PBS）洗3 次，每次5 min。0.5%TritonX-100 室溫透膜30 min，5%魚(yú)膠（Sigma）室溫封閉1 h；加入兔抗MAP2 單克隆抗體（1：400）4 ℃孵育過(guò)夜；次日復(fù)溫20 min 后PBS 漂洗3 次；Alexa 568 熒光標(biāo)記二抗（1：800）室溫避光孵育2 h。

1.2.4 Golgi-Cox 染色 浸泡好的脊髓放入用液氮冷卻的異戊烷中急凍，用冰凍切片機(jī)制備橫切片（厚度為90 μm），切片貼于滴有溶液3 的載玻片（用4%明膠包被），避光晾干過(guò)夜。切片用流動(dòng)的ddH2O 沖洗，用溶液4、5 的混合液（比例為1：1）浸染10 min，乙醇梯度脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片。

1.2.5 免疫熒光圖像處理及定量分析 免疫熒光圖片用正置顯微鏡（Leica）拍攝，在脊髓前外側(cè)角截取200 μm × 200 μm 的正方形區(qū)域，利用Image J 軟件在圖片上做橫豎各3 條間隔為50 μm 的劃線。計(jì)數(shù)MAP2 陽(yáng)性樹(shù)突與劃線的交點(diǎn)，以及與劃線交點(diǎn)數(shù)≥2的樹(shù)突個(gè)數(shù)（圖1A）。

1.2.6 Golgi-Cox 染色圖形處理及Sholl 分析 在Golgi-Cox 染色的脊髓前外側(cè)角選擇胞體和樹(shù)突顯示完整的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元，利用Image J 軟件將該神經(jīng)元及其樹(shù)突從圖像中分割出來(lái)。將神經(jīng)元胞體及樹(shù)突用軟件自動(dòng)識(shí)別生成圍繞神經(jīng)元周圍的等距同心圓環(huán)（12 μm）標(biāo)記線。計(jì)數(shù)樹(shù)突與同心圓交叉的個(gè)數(shù)[10]，在此基礎(chǔ)上統(tǒng)計(jì)每個(gè)神經(jīng)元的最長(zhǎng)樹(shù)突、總樹(shù)突長(zhǎng)度、樹(shù)突最大跨度、樹(shù)突各級(jí)別分支的數(shù)量[11～14]（圖1B）。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用SPSS 20.0 軟件（IBM，USA）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)用均值±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示。組間差異使用單因素方差分析（one-way ANOVA，Bonferroni post hoc-comparison）進(jìn)行比較，P＜0.05 認(rèn)為數(shù)據(jù)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。使用GraphPad Prism 8.0（GraphPad Software，USA）軟件作圖。

2 結(jié)果

2.1 臂叢離斷后脊髓前角樹(shù)突密度和完整度隨時(shí)間推移下降

為研究脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元樹(shù)突在周圍神經(jīng)損傷發(fā)生后隨時(shí)間發(fā)展的變化規(guī)律，將小鼠單側(cè)臂叢距離椎間孔3 mm 處離斷，術(shù)后7、14、28、56 d 取材染色。MAP2 免疫熒光結(jié)果顯示，離斷側(cè)脊髓前角MAP2 陽(yáng)性樹(shù)突的整體密度下降，且樹(shù)突結(jié)構(gòu)的退變呈時(shí)間依賴，樹(shù)突總數(shù)量減少的同時(shí)，其形態(tài)由長(zhǎng)條狀逐漸退化為片段狀（圖2A）。定量統(tǒng)計(jì)顯示樹(shù)突與測(cè)量切線交點(diǎn)總數(shù)隨時(shí)間進(jìn)程逐漸減少，表明樹(shù)突密度減少（圖2B），與切線交點(diǎn)數(shù)大于2 的樹(shù)突片段數(shù)也逐漸減少，表明樹(shù)突完整性下降（圖2C）。各時(shí)間點(diǎn)對(duì)側(cè)組均未發(fā)生顯著變化，圖2B、C 中contralateral 組所示數(shù)據(jù)為各時(shí)間點(diǎn)的平均值。

2.2 臂叢離斷后脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元樹(shù)突長(zhǎng)度及復(fù)雜度隨時(shí)間推移降低

為顯示脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元樹(shù)突結(jié)構(gòu)變化的細(xì)節(jié)，通過(guò)Golgi-Cox 染色以及Sholl 分析對(duì)單個(gè)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的樹(shù)突進(jìn)行分析，其中長(zhǎng)度指標(biāo)包括最長(zhǎng)樹(shù)突、樹(shù)突總長(zhǎng)、樹(shù)突最大跨度，復(fù)雜度指標(biāo)包括樹(shù)突第1、2、3級(jí)分支的數(shù)量。結(jié)果顯示未損傷側(cè)各項(xiàng)指標(biāo)并未隨時(shí)間變化（圖3，圖4A～E），而損傷側(cè)神經(jīng)元的樹(shù)突各項(xiàng)指標(biāo)隨時(shí)間逐漸下降，直至損傷后56 d 幾乎完全消失（圖3，圖4F～I(xiàn)，K，L）。損傷早期1 級(jí)樹(shù)突分支的數(shù)量幾乎沒(méi)有受到影響，但術(shù)后28、56 d 出現(xiàn)顯著減少（圖4J）。

2.3 不同距離臂叢神經(jīng)離斷對(duì)脊髓前角內(nèi)樹(shù)突密度和完整度的影響

如前所述，在距離椎孔3 mm 進(jìn)行臂叢神經(jīng)離斷后28 d 脊髓前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元樹(shù)突各項(xiàng)指標(biāo)均發(fā)生顯著的退變，而56 d 時(shí)已幾乎觀察不到完整的樹(shù)突結(jié)構(gòu)，因此選擇28 d 進(jìn)行遠(yuǎn)距離（10 mm）與近距離（3 mm）臂叢神經(jīng)離斷后樹(shù)突退化的比較。MAP2 熒光染色結(jié)果顯示，遠(yuǎn)距離損傷后脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元樹(shù)突總密度下降情況較輕，與對(duì)照的近距離損傷組差異顯著（圖4A，B）。但樹(shù)突完整度的下降并未受到距離因素的顯著影響（圖4C）。

2.4 不同距離臂叢離斷對(duì)脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元樹(shù)突長(zhǎng)度及復(fù)雜度的影響

為進(jìn)一步探索周圍神經(jīng)損傷距離影響運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元樹(shù)突樹(shù)結(jié)構(gòu)退化的差異，遠(yuǎn)距離（10 mm）與近距離（3 mm）臂叢離斷28 d 的脊髓同步做Golgi-Cox 染色和Sholl 分析（圖6）。結(jié)果顯示，遠(yuǎn)距離損傷側(cè)的長(zhǎng)度指標(biāo)下降幅度遠(yuǎn)低于近距離的損傷側(cè)（圖7A～G）。然而，關(guān)于復(fù)雜度的統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，1 級(jí)、2 級(jí)、3 級(jí)樹(shù)突分支數(shù)在兩組的損傷側(cè)之間均未有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（圖7H～J）。

3 討論

周圍神經(jīng)遍布全身，各種創(chuàng)傷可造成不同程度的周圍神經(jīng)損傷。當(dāng)損傷部位靠近中樞近端的神經(jīng)主干時(shí)，神經(jīng)再生十分困難，且涉及的因素比較復(fù)雜，神經(jīng)元樹(shù)突退變就是其中之一[15]。王樹(shù)森等人[2]發(fā)現(xiàn)大鼠坐骨神經(jīng)離斷會(huì)造成運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元胞體總體積下降，進(jìn)而說(shuō)明損傷后脊髓前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的樹(shù)突會(huì)產(chǎn)生持續(xù)性收縮。劉蔡鉞[16]發(fā)現(xiàn)，小鼠坐骨神經(jīng)離斷會(huì)導(dǎo)致脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元周圍突觸數(shù)下降。Wiberg 等人[17]在基于大鼠L4～5腹根撕脫傷和遠(yuǎn)端周圍神經(jīng)切斷的研究中，發(fā)現(xiàn)脊髓前角神經(jīng)末梢的突觸素和MAP2 含量顯著減少，表明周圍神經(jīng)切斷顯著降低突觸頻率和減少樹(shù)突分支。然而，以上的研究主要以坐骨神經(jīng)或臂叢撕脫的模型為基礎(chǔ)，關(guān)注于運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元胞體本身或突觸的變化，未具體闡述周圍神經(jīng)損傷后樹(shù)突的結(jié)構(gòu)和形態(tài)的退變過(guò)程和變化規(guī)律。

本研究采用小鼠臂叢離斷模型，該模型具有以下優(yōu)點(diǎn)：①臂叢相對(duì)坐骨神經(jīng)來(lái)說(shuō)，離脊髓距離更近，臂叢離斷后，脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元樹(shù)突退變將更加明顯，有助于探明損傷后樹(shù)突形態(tài)變化的規(guī)律；②臂叢離斷模型相對(duì)夾傷模型而言，排除了軸突再生以及樹(shù)突重塑對(duì)結(jié)果的影響。為更全面評(píng)估樹(shù)突形態(tài)的變化，選擇樹(shù)突總長(zhǎng)度、樹(shù)突最大跨度和最長(zhǎng)樹(shù)突的長(zhǎng)度，以及各級(jí)分支的數(shù)量來(lái)評(píng)價(jià)樹(shù)突的形態(tài)變化。其中樹(shù)突總長(zhǎng)度和最長(zhǎng)樹(shù)突可指示樹(shù)突間的相互作用、評(píng)價(jià)樹(shù)突傳入功能以及突觸數(shù)量[18]，樹(shù)突最大跨度則標(biāo)志著樹(shù)突信號(hào)接收的最大范圍[19]。樹(shù)突各級(jí)分支數(shù)量是評(píng)價(jià)樹(shù)突復(fù)雜程度的重要指標(biāo)，反映了樹(shù)突接受神經(jīng)信號(hào)的效率[11]，其中，初級(jí)（1 級(jí)）分支數(shù)反映樹(shù)突的發(fā)育是否健全[20]，高級(jí)（2 級(jí)以上）分支的數(shù)量代表樹(shù)突的生長(zhǎng)狀態(tài)，其數(shù)量增多代表樹(shù)突處于旺盛生長(zhǎng)[21]。

基于臂叢離斷模型及上述樹(shù)突評(píng)價(jià)指標(biāo)，本研究首次闡明臂叢損傷后脊髓前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的樹(shù)突結(jié)構(gòu)和形態(tài)的退變規(guī)律。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，臂叢損傷7 d 后樹(shù)突總密度和完整度顯著下降，單個(gè)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元樹(shù)突的長(zhǎng)度以及復(fù)雜度開(kāi)始出現(xiàn)顯著的退化，且退化程度隨時(shí)間推移而加劇。這意味著樹(shù)突接收信號(hào)范圍變小，與周圍樹(shù)突交流和互相作用的能力下降，且周圍神經(jīng)損傷不但直接引起了脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元樹(shù)突固有結(jié)構(gòu)退變還可能影響其已經(jīng)穩(wěn)定的生長(zhǎng)狀態(tài)。相比于損傷區(qū)域在早期就開(kāi)始發(fā)生華勒變性的軸突[22]，樹(shù)突退變的進(jìn)程更加緩慢持久。軸突損傷28 d 后往往已能夠再生甚至實(shí)現(xiàn)靶器官再支配，而本研究發(fā)現(xiàn)臂叢離斷28 d 后最長(zhǎng)樹(shù)突、樹(shù)突總長(zhǎng)、樹(shù)突最大跨度，復(fù)雜度指標(biāo)包括樹(shù)突第1、2、3 級(jí)分支的數(shù)量均出現(xiàn)明顯的退變。這也正好解釋了即使軸突實(shí)現(xiàn)再生、靶器官再支配，運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)效果仍不如意的情況。緊接著構(gòu)建了不同距離（3 mm 和10 mm）的臂叢離斷傷模型，在樹(shù)突退變較顯著的離斷28 d 比較不同距離離斷后樹(shù)突結(jié)構(gòu)的變化。結(jié)果提示，兩種距離離斷引起樹(shù)突復(fù)雜度降低的情況沒(méi)有顯著差異，但遠(yuǎn)距離離斷組樹(shù)突長(zhǎng)度下降幅度遠(yuǎn)低于近距離離斷組。由此可見(jiàn)，距離因素雖對(duì)樹(shù)突復(fù)雜度退變的影響不大，但對(duì)樹(shù)突長(zhǎng)度退變的影響十分明顯。這也解釋了臨床慢性周圍神經(jīng)損傷患者修復(fù)手術(shù)后功能修復(fù)效果差以及越靠近身體近側(cè)端的周圍神經(jīng)損傷越難修復(fù)的問(wèn)題。

綜上，本研究揭示了小鼠臂叢離斷后樹(shù)突退變結(jié)構(gòu)與形態(tài)隨時(shí)間的變化及不同距離的臂叢離斷樹(shù)突退變的差異。提示關(guān)于周圍神經(jīng)修復(fù)的研究不僅需要關(guān)注損傷區(qū)的軸突及髓鞘的再生，還需要關(guān)注受損神經(jīng)元樹(shù)突的退化及再生的病理變化及相關(guān)作用機(jī)制。緩解樹(shù)突的退變及促進(jìn)樹(shù)突有效重塑將是提高周圍神經(jīng)損傷修復(fù)的重要策略。