趙陽超，喬晨暉#，馬 寧，Stig Steen

1)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院心血管外科鄭州 450052 2)瑞典隆德大學(xué)醫(yī)院心胸外科生命科學(xué)實(shí)驗(yàn)室隆德 22594 #通訊作者，男，1961年9月生，教授，研究方向:心臟移植，E-mail:qchenhui@hotmail.com

急性缺血再灌注損傷對(duì)豬心冠狀動(dòng)脈功能的影響

趙陽超1)，喬晨暉1)#，馬 寧1)，Stig Steen2)

1)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院心血管外科鄭州 450052 2)瑞典隆德大學(xué)醫(yī)院心胸外科生命科學(xué)實(shí)驗(yàn)室隆德 22594 #通訊作者，男，1961年9月生，教授，研究方向:心臟移植，E-mail:qchenhui@hotmail.com

冠狀動(dòng)脈;內(nèi)皮細(xì)胞;平滑肌;內(nèi)皮依賴性舒張;缺血再灌注損傷;豬

目的:探討急性缺血再灌注損傷對(duì)豬心冠狀動(dòng)脈功能的影響。方法:健康瑞典家豬24頭，隨機(jī)分為3組:對(duì)照組、缺血組、缺血再灌注組，每組8頭。對(duì)照組開胸后觀察1 h，直接切取心臟;缺血組阻斷左冠狀動(dòng)脈前降支中下1/3交界處1 h后切取心臟;缺血再灌注組阻斷左冠狀動(dòng)脈前降支中下1/3交界處30 min然后再灌注30 min后切取心臟。3組均進(jìn)行器官浴槽實(shí)驗(yàn)，評(píng)價(jià)冠狀動(dòng)脈平滑肌和內(nèi)皮細(xì)胞的功能。結(jié)果:對(duì)照組、缺血組、缺血再灌注組的平滑肌最大收縮值分別為16.94(10.22～24.24)、13.03(8.92～16.94)和8.76(5.97～14.91)mN，最大舒張值均為100%，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);最大內(nèi)皮依賴性舒張百分?jǐn)?shù)(EDRmax)分別為(97.66± 1.86)%、(89.52±0.96)%和(85.21±2.60)%，舒張至50%最大收縮時(shí)P物質(zhì)濃度的負(fù)對(duì)數(shù)(pEC50)分別為(9.51±0.80)、(8.19±0.35)和(7.64±0.24)，3組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=86.010、26.780，P均＜0.001);與對(duì)照組相比，缺血組和缺血再灌注組EDRmax和pEC50均降低(P＜0.05)，缺血再灌注組降低更明顯(P＜0.05)。結(jié)論:急性缺血再灌注明顯損傷豬心冠狀動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞的功能。

盡早恢復(fù)冠脈血流是目前治療缺血性心臟病的有效手段，如溶栓術(shù)、冠狀動(dòng)脈搭橋術(shù)、經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈內(nèi)球囊擴(kuò)張和支架植入術(shù)等［1］，但是眾多研究［2-3］結(jié)果表明再灌注是一把雙刃劍，會(huì)引起心肌更嚴(yán)重的損傷。近年來對(duì)缺血再灌注損傷的研究主要集中在心肌組織，而對(duì)冠狀動(dòng)脈尤其是內(nèi)皮細(xì)胞的缺血再灌注損傷研究較少，因此研究缺血再灌注損傷時(shí)冠脈血管尤其是內(nèi)皮細(xì)胞的功能狀態(tài)，對(duì)于盡可能減少再灌注損傷具有重要的指導(dǎo)意義。基于此，該實(shí)驗(yàn)以豬心冠狀動(dòng)脈左前降支(LAD)中下1/3血管為對(duì)象，采用器官浴槽實(shí)驗(yàn)，評(píng)價(jià)缺血再灌注損傷對(duì)血管的內(nèi)皮細(xì)胞依賴性舒張功能的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康瑞典家豬24頭，由瑞典隆德大學(xué)醫(yī)院心胸外科生命科學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供，雌雄不拘，體質(zhì)量(35±2)kg。課題經(jīng)瑞典隆德大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 主要藥品和儀器 麻醉藥品(氯胺酮、甲苯塞嗪、硫噴妥鈉、阿托品、泮庫溴銨);Krebs溶液，含NaCl 119 mmol/L，KCl 4.6 mmol/L，MgCl21.2 mmol/L，CaCl21.5 mmol/L，NaHCO315 mmol/L，NaH2PO41.2 mmol/L，葡萄糖11 mmol/L，為新鮮配制;血栓素A2類似物U-46619;P物質(zhì);罌粟堿。Stemi 1000型手術(shù)顯微鏡;7E型多導(dǎo)記錄儀及FT03D型張力傳感器;肌動(dòng)描記器;呼吸機(jī)(Siemens Servo ventilator300A);心電監(jiān)測儀 (Medtronic LIFEPAK 12);血壓監(jiān)測儀(Spacelabs Medical)。以上藥品和儀器均由瑞典隆德大學(xué)醫(yī)院心胸外科生命科學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組 將24頭豬按隨機(jī)數(shù)字表法分為3組，對(duì)照組、缺血組及缺血再灌注組，每組8頭。麻醉后給予氣管插管，呼吸機(jī)輔助呼吸。備皮消毒，正中開胸，充分暴露心臟。對(duì)照組開胸后觀察1 h，直接切取心臟。余2組游離LAD中下1/3交界處，缺血組直接阻斷1 h，然后切取心臟;缺血再灌注組在阻斷位點(diǎn)處放置橡皮套管，收緊橡皮套管30 min后，再開放30 min，然后切取心臟。

1.4 心臟切取和冠狀動(dòng)脈標(biāo)本的制備 取心臟時(shí)均先全身肝素化(400 U/kg)，開胸，結(jié)扎下腔靜脈，阻斷升主動(dòng)脈后立即在根部灌注4℃心臟停搏液，快速剪開上腔靜脈、左心耳，避免心臟過度充盈，待心臟均勻降溫、停跳滿意后，取出心臟，置于4℃心臟停搏液中。遵循無創(chuàng)剝離的原則，在手術(shù)顯微鏡下，取出約1 cm長的LAD中下1/3交界處遠(yuǎn)端血管(外徑1.0～1.5 mm)。然后將其截成約1 mm長的完整血管環(huán)，一般3段即可。標(biāo)本制備時(shí)間小于20 min。

1.5 冠狀動(dòng)脈功能測定

1.5.1 測定環(huán)境 器官浴槽內(nèi)持續(xù)充以體積分?jǐn)?shù)95%O2和體積分?jǐn)?shù)5%CO2的混合氣，使Krebs溶液達(dá)到氧合、生理pH值(約7.40)，每隔15 min更換溶液1次。器官浴槽容量為5 mL，恒溫37℃的蒸餾水可以通過環(huán)繞浴槽的空腔持續(xù)循環(huán)，從而保證浴槽恒溫。每次實(shí)驗(yàn)前，充入Krebs溶液溫浴至少30 min。溫浴后，在手術(shù)顯微鏡下，將血管環(huán)無創(chuàng)懸掛于器官浴槽內(nèi)兩個(gè)平行的L形金屬掛鉤上，一端掛鉤連接螺旋移動(dòng)器，以此牽拉、調(diào)節(jié)冠狀動(dòng)脈環(huán)張力;另一端掛鉤連接張力傳感器，并與Grass 7E型多導(dǎo)記錄儀連接，用于持續(xù)測定冠狀動(dòng)脈環(huán)的等長張力。

1.5.2 冠狀動(dòng)脈環(huán)功能測定 調(diào)零后反復(fù)牽拉血管，調(diào)節(jié)張力平衡至基礎(chǔ)張力。此時(shí)測量2個(gè)金屬掛鉤之間的距離，作為平衡時(shí)冠狀動(dòng)脈環(huán)的內(nèi)徑。再次調(diào)零后用5.7×10－7mol/L的U-46619共10 μL誘導(dǎo)血管環(huán)預(yù)收縮，達(dá)到最大張力后反復(fù)更換Krebs溶液直至恢復(fù)基礎(chǔ)張力，再次加入相同劑量、濃度的U-46619誘導(dǎo)血管環(huán)第2次收縮達(dá)到最大張力，穩(wěn)定時(shí)的張力值即為預(yù)收縮值，以此作為最大收縮值(Cmax)。當(dāng)血管環(huán)收縮達(dá)到預(yù)收縮值之后，依次向浴槽內(nèi)加入50 μL濃度遞增的P物質(zhì)(10－14～10－6mol/L)，誘導(dǎo)內(nèi)皮依賴性舒張(endothelium dependent relaxation，EDR)。計(jì)算誘導(dǎo)的最大EDR占最大收縮的百分?jǐn)?shù)，即最大舒張百分?jǐn)?shù)(EDRmax);同時(shí)計(jì)算EDR為最大收縮的50%時(shí)P物質(zhì)濃度的負(fù)對(duì)數(shù)(pEC50)。最后加入50 μL 10－4mmol/L的罌粟堿，測試3組血管環(huán)能否達(dá)到最大舒張(Rmax)。1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 17.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。3組EDRmax、pEC50、血管內(nèi)徑的比較均應(yīng)用單因素方差分析及LSD-t檢驗(yàn);Cmax指標(biāo)不符合正態(tài)分布，故采用M(P25～P75)報(bào)告結(jié)果，并采用秩和檢驗(yàn)進(jìn)行3組間比較;檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 3組冠狀動(dòng)脈環(huán)內(nèi)徑的比較 在基礎(chǔ)張力下，對(duì)照組、缺血組及缺血再灌注組的冠狀動(dòng)脈環(huán)內(nèi)徑分別為(1.25±0.18)、(1.19±0.21)和(1.31± 0.21)mm，3組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=0.629，P=0.543)。

2.2 3組U-46619誘導(dǎo)的血管平滑肌Cmax的比較對(duì)照組、缺血組、缺血再灌注組U-46619誘導(dǎo)的血管平滑肌的Cmax分別為16.94(10.22～24.24)、13.03 (8.92～16.94)和8.76(5.97～14.91)mN，3組間比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=3.935，P=0.140); Rmax均為100%。

2.3 3組內(nèi)皮細(xì)胞EDRmax、pEC50的比較 結(jié)果見表1。

表13 組內(nèi)皮細(xì)胞EDRmax、pEC50的比較

3 討論

近年來，對(duì)缺血再灌注損傷的研究主要集中在心肌組織［4-5］，而對(duì)冠狀動(dòng)脈尤其是內(nèi)皮細(xì)胞的缺血再灌注損傷研究較少。冠狀動(dòng)脈尤其是內(nèi)皮細(xì)胞功能在心肌缺血性損傷中的重要性越來越引起重視，其功能可通過器官浴槽實(shí)驗(yàn)測定的內(nèi)皮依賴性舒張來評(píng)價(jià)［5］。在器官浴槽實(shí)驗(yàn)中，罌粟堿通過作用于冠狀動(dòng)脈血管平滑肌，抑制磷酸二酯酶，增加血管平滑肌細(xì)胞內(nèi)cGMP生成，減少鈣離子內(nèi)流，引起冠狀動(dòng)脈平滑肌舒張，是一種非內(nèi)皮細(xì)胞依賴性血管舒張劑。U-46619是一種穩(wěn)定的內(nèi)皮非依賴性血管收縮劑。P物質(zhì)通過與內(nèi)皮上的相關(guān)受體結(jié)合，刺激內(nèi)皮釋放內(nèi)皮源性舒張因子(endothelium derived relaxing factor，EDRF)，作用于平滑肌，從而發(fā)揮血管舒張作用［6］。

該研究結(jié)果表明，在冠脈缺血恢復(fù)血流后，冠狀動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞的依賴性舒張功能比缺血組下降更明顯，其原因可能有以下幾點(diǎn)。①血管緊張素Ⅱ:再灌注時(shí)，血管緊張素Ⅱ生成增加，促進(jìn)交感神經(jīng)釋放兒茶酚胺、收縮血管、刺激醛固酮分泌、促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞水腫等［7］。②氧自由基:氧自由基對(duì)細(xì)胞膜的損傷主要表現(xiàn)在其可與膜內(nèi)多價(jià)不飽和脂肪酸作用，使之發(fā)生氧化，造成多種損害，破壞膜的正常結(jié)構(gòu)，間接抑制膜蛋白功能，減少ATP生成，抑制蛋白質(zhì)功能，破壞核酸及染色體［8］。③鈣超載:再灌注后，胞質(zhì)內(nèi)鈣離子濃度明顯增加，鈣離子與線粒體內(nèi)含磷酸根的化合物結(jié)合，形成不溶性磷酸鈣，干擾線粒體的氧化磷酸化，使ATP生成減少［9］。④白細(xì)胞:再灌注后，大量白細(xì)胞聚集在缺血區(qū)的微血管內(nèi)，導(dǎo)致微血管機(jī)械性堵塞［10］。⑤無復(fù)流現(xiàn)象:是指缺血再灌注時(shí)，部分或者全部缺血組織不出現(xiàn)血液灌流的現(xiàn)象。原因可能是微血管障礙及中性粒細(xì)胞栓塞，血小板或者血栓堵塞微血管，膨脹的心肌細(xì)胞擠壓微血管［11］。⑥能量代謝障礙:再灌注時(shí)，因合成ATP的底物被沖出內(nèi)皮細(xì)胞，或者因無復(fù)流現(xiàn)象，ATP無法進(jìn)入內(nèi)皮細(xì)胞，以致高能化合物合成障礙;再灌注時(shí)，盡管供給內(nèi)皮細(xì)胞富含氧血，但因在內(nèi)皮細(xì)胞缺血或者再灌注時(shí)，線粒體受損，出現(xiàn)用氧障礙;再灌注時(shí)，細(xì)胞膜Na+-H+交換、Na+-Ca2+交換相繼被激活，而這些過程具有能量依賴性，使ATP消耗增加［12］。

另外，作者還觀察到，3組之間平滑肌舒縮功能差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明平滑肌細(xì)胞的抗損傷能力優(yōu)于內(nèi)皮細(xì)胞。

總之，該研究結(jié)果表明，短暫的冠脈缺血再灌注會(huì)導(dǎo)致冠狀動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞功能的急性損傷，因而，非常有必要進(jìn)一步研究其發(fā)生機(jī)制、演變過程及內(nèi)皮細(xì)胞的修復(fù)機(jī)制等，進(jìn)而對(duì)預(yù)防或減少冠狀動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞的缺血再灌注損傷提供有效的解決方案。

［1］ Azambuja AP，Portillo-Sanchez V，Rodrigues MV，et al.Retinoic acid and VEGF delay smooth muscle relative to endothelial differentiation to coordinate inner and outer coronary vessel wall morphogenesis［J］.Circ Res，2010，107(2):204

［2］Brinks H，Boucher M，Gao E，et al.Level of G protein-coupled receptor kinase-2 determines myocardial ischemia/ reperfusion injury via pro-and anti-apoptotic mechanisms［J］.Circ Res，2010，107(9):1140

［3］Chu LM，Osipov RM，Robich MP，et al.Effect of thrombin fragment(TP508)on myocardial ischemia reperfusion injury in a model of type 1 diabetes mellitus［J］.Circulation，2010，122(11 suppl):S162

［4］張艷芳，李秀敏，楊瑞.p53 mRNA和Caspase-3 mRNA在幼年大鼠心肌缺血再灌注損傷中的動(dòng)態(tài)表達(dá)及藥物干預(yù)作用［J］.實(shí)用兒科臨床雜志，2009，24(13):1006

［5］馬寧，張偉華，周志明，等.間斷與持續(xù)低溫灌注對(duì)離體豬心冠狀動(dòng)脈功能的影響［J］.鄭州大學(xué)學(xué)報(bào):醫(yī)學(xué)版，2009，44(6):1224

［6］Ciccarelli M，Chuprun J，Rengo G，et al.G protein-coupled receptor kinase 2 activity impairs cardiac glucose uptake and promotes insulin resistance after myocardial ischemia［J］.Circulation，2011，123(18):1953

［7］Demers P，Elkouri S，Sirois MG，et al.Coronary artery endothelial dysfunction after ischemia-reperfusion and acute untreated rejection in a canine heterotopic heart transplantation model［J］.Transplantation，2001，71(1):26

［8］Zhai P，Sciarretta S，Galeotti J，et al.Differential roles of GSK-3β during myocardial ischemia and ischemia/reperfusion［J］.Circ Res，2011，109(5):502

［9］Kapoor A，Collino M，Castiglia S，et al.Activation of peroxisome proliferator-activated receptor-beta/delta attenuates myocardial ischemia/reperfusion injury in the rat［J］.Shock，2010，34(2):117

［10］Kempf T，Eden M，Strelau J，et al.The transforming growth factor-beta superfamily member growth-differentiation factor-15 protects the heart from ischemia/reperfusion injury［J］.Circ Res，2006，98(3):351

［11］Kondo K，Shibata R，Unno K，et al.Impact of a single intracoronary administration of adiponectin on myocardial ischemia/reperfusion injury in a pig model［J］.Circ Cardiovasc Interv，2010，3(2):166

［12］Korkmaz S，Radovits T，Barnucz E，et al.Pharmacological activation of soluble guanylate cyclase protects the heart against ischemic injury［J］.Circulation，2009，120(8):677

Effects of acute ischemia-reperfusion injury on coronary artery function of porcine heart

ZHAO Yangchao1)，QIAO Chenhui1)，MA Ning1)，Stig Steen2)1)Department of Cardiovascular Surgery，the First Affiliated Hospital，Zhengzhou University，Zhengzhou 450052 2)The Life and Science Laboratory of Cardiothoracic Surgery，Lund University Hospital，Lund SE-22594

coronary artery;endothelial cell;smooth muscle;endothelium dependent relaxation;ischemia-reperfusion injury;porcine

Aim:To investigate the effects of acute ischemia-reperfusion injury on coronary artery function in porcine hearts.Methods:Twenty four Swedish domestic pigs were randomly divided into three groups:control group，ischemia group，ischemia-reperfusion group，eight in each group.The hearts in control group were observed for 1 h after thoracotomy and then were removed directly.The hearts in ischemia group were removed after 1 h occlusion of left anterior descending distal coronary artery(LAD).The hearts in ischemia-reperfusion group were removed after 30 min of occlusion and 30 min of reperfusion of LAD.Then the functions of smooth muscle and endothelial cells of LAD were evaluated in organ baths.Results:The maximal contraction(Cmax)of smooth muscle in control，ischemia，and ischemia-reperfusion group were 16.94(10.22～24.24)，13.03(8.92～16.94)and 8.76(5.97～14.91)mN，respectively，and the maximal relaxation percentage(Rmax)of smooth muscle were all 100%.There were no significant differences in Cmaxand Rmaxamong the 3 groups(P＞0.05).The maximal endothelium dependent relaxation(EDRmax)were(97.66±1.86)%，(89.52±0.96)%and(85.21±2.60)%，and the negative logarithm of the concentration of P substance(pEC50)were(9.51±0.80)，(8.19±0.35)，and(7.64±0.24).There were significant differences in EDRmaxand pEC50 among the 3 groups(F=86.010，26.780，P＜0.001).Compared with those of the control group and ischemia group，both EDRmaxand pEC50 in ischemia-reperfusion group were lower(P＜0.05).Conclusion:Acute ischemia-reperfusion can injure the function of endothelial cells of porcine heart.

R654.2

10.3969/j.issn.1671-6825.2012.06.022

(2012-02-15收稿 責(zé)任編輯王 曼)