陸永光，符春暉，嚴(yán) 華，陳湘桂，黃軍章，陳麗媛

欽州市第二人民醫(yī)院心內(nèi)科欽州 535099

△男，1977年10月生，博士，副主任醫(yī)師，研究方向:冠心病的診治，E-mail:evershine_lu@hotmail.com

阿托伐他汀對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞微粒誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞ERK、p38MAPK、NF-κB p65蛋白及ICAM-1mRNA表達(dá)的影響*

陸永光△，符春暉，嚴(yán) 華，陳湘桂，黃軍章，陳麗媛

欽州市第二人民醫(yī)院心內(nèi)科欽州 535099

△男，1977年10月生，博士，副主任醫(yī)師，研究方向:冠心病的診治，E-mail:evershine_lu@hotmail.com

內(nèi)皮細(xì)胞微粒;臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞;絲裂素活化蛋白激酶;細(xì)胞間黏附分子-1;阿托伐他汀

目的:探討阿托伐他汀干預(yù)對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞微粒(EMPs)誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)ERK/MAPK和NF-κB信號(hào)通路及細(xì)胞間黏附分子-1(ICAM-1)表達(dá)的影響。方法:將體外培養(yǎng)的HUVEC細(xì)胞系ECV-304分組培養(yǎng):①EMPs不同作用時(shí)間組用EMPs(終濃度105mL－1)分別刺激細(xì)胞0、3、6、12和24 h。②EMPs不同作用劑量組分別用終濃度為0、102、103、104及105mL－1的EMPs刺激細(xì)胞24 h。③抑制劑預(yù)處理組在EMPs刺激前，分別用ERK、p38MAPK及NF-κB抑制劑PD98059、SB203580、PDTC進(jìn)行預(yù)處理。④阿托伐他汀預(yù)處理組在EMPs刺激前，用阿托伐他汀進(jìn)行預(yù)處理。然后，用實(shí)時(shí)熒光定量PCR測(cè)定細(xì)胞中ICAM-1 mRNA的表達(dá)，Western blot法測(cè)定磷酸化ERK(p-ERK)、p-p38MAPK、NF-κB p65蛋白的表達(dá)。結(jié)果:隨EMPs作用時(shí)間的延長(zhǎng)和作用劑量的增加，細(xì)胞p-ERK、p-p38MAPK、NF-κB p65蛋白及ICAM-1 mRNA的表達(dá)均逐漸增加(P均＜0.001)。用上述抑制劑及阿托伐他汀預(yù)處理后，EMPs誘導(dǎo)的細(xì)胞ICAM-1 mRNA表達(dá)均降低(P＜0.05)。結(jié)論:阿托伐他汀可能通過ERK/MAPK和NF-κB信號(hào)通路下調(diào)EMPs誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞ICAM-1的表達(dá)。

內(nèi)皮細(xì)胞微粒(endothelial microparticles， EMPs)是內(nèi)皮細(xì)胞激活、損傷或凋亡后從細(xì)胞膜釋放出來的小微粒［1］。近年來研究［2］表明，EMPs不僅可以作為內(nèi)皮損傷和功能障礙的標(biāo)志物，而且攜帶有大量的生物活性物質(zhì)，可以發(fā)揮明顯的生物學(xué)效應(yīng)。細(xì)胞間黏附分子1(intercellular adhesion molecule 1，ICAM-1)主要由內(nèi)皮細(xì)胞合成和分泌，在介導(dǎo)單核細(xì)胞等炎性細(xì)胞黏附于內(nèi)皮細(xì)胞并進(jìn)入內(nèi)膜的過程中發(fā)揮重要作用［3］。ERK/MAPK和NF-κB是介導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞炎性反應(yīng)和炎性因子表達(dá)的重要信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路［4］。阿托伐他汀除了具有調(diào)脂作用外，還具有抑制內(nèi)皮炎癥，保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞的作用［5］。作者用阿托伐他汀干預(yù)EMPs誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cell，HUVEC)，觀察ERK、p38MAPK、NF-κB p65蛋白及ICAM-1 mRNA表達(dá)的變化。

1 材料與方法

1.1 材料 HUVEC細(xì)胞系ECV-304(美國(guó)ATCC公司);胎牛血清及RPMI 1640培養(yǎng)基(美國(guó)Gibco公司);TNF-α(英國(guó)PeProtech公司);異氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記的CD42單克隆抗體、藻紅蛋白(PE)標(biāo)記的CD31單克隆抗體(美國(guó)Proteintech Group公司);0.8、3.0 μm標(biāo)準(zhǔn)微粒(美國(guó)Duke公司);阿托伐他汀(美國(guó)輝瑞公司);ERK抑制劑PD98059、p38MAPK抑制劑SB203580、NF-κB抑制劑二硫代氨基甲酸吡咯烷(PDTC)(美國(guó)Sigma公司);PCR引物(上海生工生物工程有限公司);第一鏈cDNA合成試劑盒、All-in-OneTMQ-PCR Mix(美國(guó)GeneCopoeia公司);核蛋白提取試劑盒、ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒(美國(guó)Pierce公司);辣根過氧化酶(HRP)標(biāo)記羊抗兔IgG和DAB染色試劑盒(丹麥DAKO公司);兔抗人磷酸化ERK(p-ERK)、磷酸化p38MAPK(pp38MAPK)單克隆抗體，兔抗人ERK、p38MAPK、NF-κB p65單克隆抗體和兔抗人增殖細(xì)胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)單克隆抗體(美國(guó)Santa Cruz公司)。

1.2 EMPs的制備及鑒定 參照Terrisse等［6］的方法，在37℃下，用終質(zhì)量濃度為100 μg/L的TNF-α與ECV-304共孵育48 h，制備EMPs。取制備好的EMPs樣品100 μL分成2管，一管加入FITC標(biāo)記CD42單克隆抗體和PE標(biāo)記CD31單克隆抗體各10 μL，另一管加入等量的對(duì)照抗體，在室溫下孵育15 min，洗滌2次后，加入100 μL PBS后上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。用0.8 μm的標(biāo)準(zhǔn)微粒設(shè)門，以3 μm標(biāo)準(zhǔn)微粒對(duì)EMPs進(jìn)行定量。上流式細(xì)胞儀前，樣品中分別加入105個(gè)0.8 μm和3.0 μm標(biāo)準(zhǔn)微粒，測(cè)定直徑0.8～3.0 μm的細(xì)胞膜微粒，當(dāng)收集到2×104個(gè)3 μm標(biāo)準(zhǔn)微粒后即停止計(jì)數(shù)，并以此作為參照標(biāo)準(zhǔn)計(jì)算EMPs濃度。EMPs定義為直徑＜1.0 μm且CD31+/CD42－的微粒。

1.3 ECV-304的培養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)分組 用含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清、青霉素100 kU/L、鏈霉素100 kU/L的RPMI 1640培養(yǎng)基，在37℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2條件下培養(yǎng)ECV-304，待細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)亞融合狀態(tài)時(shí)，用2.5 g/L胰蛋白酶消化、傳代，取2～5代增殖旺盛的細(xì)胞，用含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基調(diào)整為105mL－1的細(xì)胞懸液，接種于24孔板，待細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，使其同步化，隨后按以下分組進(jìn)行干預(yù)。①EMPs不同作用時(shí)間組:用EMPs(終濃度105mL－1)分別刺激細(xì)胞0、3、6、12、24 h。②EMPs不同作用劑量組:分別用終濃度為0、102、103、104、105mL－1的EMPs刺激細(xì)胞24 h。③抑制劑預(yù)處理組:在EMPs刺激前，分別將細(xì)胞與PD98059(終濃度為10 μmol/L)、SB203580(終濃度為10 μmol/L)和PDTC(終濃度為10 μmol/L)共同孵育30 min。④阿托伐他汀預(yù)處理組:在EMPs刺激前，用阿托伐他汀(終濃度為10 μmol/L)孵育細(xì)胞30 min。

1.4 觀測(cè)指標(biāo)

1.4.1 p-ERK、p-p38 MAPK、NF-κB p65蛋白的Western blot檢測(cè) 收集上述各組細(xì)胞，采用Bradford法進(jìn)行蛋白定量，電泳和轉(zhuǎn)膜后封閉2 h，滴加一抗(按500倍稀釋)，4℃孵育過夜，然后加相應(yīng)的二抗(按5 000倍稀釋)，室溫下孵1 h。ECL化學(xué)發(fā)光顯影、曝光。用圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行圖像掃描及灰度分析。用p-ERK或p38MAPK與同管內(nèi)參照總ERK或 p38MAPK灰度值的比值表示 p-ERK或 pp38MAPK的相對(duì)表達(dá)量，用NF-κB p65與同管內(nèi)參照PCNA條帶灰度值的比值表示NF-κB p65的相對(duì)表達(dá)量。

1.4.2 ICAM-1 mRNA的Real Time-PCR檢測(cè) 收集各組細(xì)胞，Trizol一步法提取總RNA，按試劑盒說明進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)得 cDNA，以此為模板，進(jìn)行PCR。引物序列:ICAM-1上游為5’-CCGGAAGGT GTATGAACTG-3’，下游為5’-TCCATGGTGATCTCT CCTC-3’;β-actin上游為5’-TGACGTGGACATCCG CAAAG-3’，下游為5’-CTGGAAGGTGGACAGCGA GG-3’。PCR反應(yīng)體系20 μL:2×All-in-OneTMQPCR Mix 10 μL，上、下游引物各2 μL，cDNA 2 μL，ddH2O 4 μL。反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性10 min;95℃變性10 s，60℃退火20 s，72℃延伸31 s;40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)行擴(kuò)增曲線和熔解曲線分析，采用2－ΔΔCt法計(jì)算 ICAM-1 mRNA表達(dá)量，ΔΔCt= (Ct目的基因－ Ct內(nèi)參基因)實(shí)驗(yàn)組－ (Ct目的基因－Ct內(nèi)參基因)對(duì)照組。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 用SPSS 13.0處理數(shù)據(jù)。EMPs不同作用時(shí)間、不同作用劑量各組p-ERK、p-p38 MAPIL、NF-κB p65蛋白及ICAM-1 mRNA相對(duì)表達(dá)量組間比較方差不齊，采用Kruskal-Wallis秩和檢驗(yàn)，兩兩比較采用Bonferroni法;采用析因設(shè)計(jì)的方差分析評(píng)價(jià)抑制劑預(yù)處理對(duì)EMPs誘導(dǎo)的ECV304細(xì)胞以及阿托伐他汀對(duì)EMPs誘導(dǎo)的HUVECs細(xì)胞ICAM-1 mRNA表達(dá)的影響，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 EMPs作用不同時(shí)間 ECV-304細(xì)胞中 p-ERK、p-p38MAPK、NF-κB p65蛋白及ICAM-1 mRNA的表達(dá) 見圖1和表1?？梢钥闯?，隨EMPs作用時(shí)間的延長(zhǎng)，ECV-304細(xì)胞 p-ERK、pp38MAPK、NF-κB p65蛋白及ICAM-1 mRNA的表達(dá)均逐漸增加。

圖1 EMPs作用不同時(shí)間后ECV-304細(xì)胞p-ERK、p-p38MAPK、NF-κB p65蛋白Western blot電泳圖

表1 EMPs作用不同時(shí)間后ECV-304細(xì)胞p-ERK、p-p38MAPK、NF-κB p65蛋白及ICAM-1 mRNA的表達(dá)

2.2 不同劑量EMPs作用后ECV-304細(xì)胞p-ERK、p-p38MAPK、NF-κB p65蛋白及ICAM-1 mRNA的表達(dá) 見圖2和表2。可以看出，隨EMPs劑量的增加，ECV-304細(xì)胞p-ERK、p-p38MAPK、NF-κB p65蛋白及ICAM-1 mRNA的表達(dá)均逐漸增加。

2.3 抑制劑對(duì) EMPs誘導(dǎo)的 ECV-304細(xì)胞ICAM-1 mRNA表達(dá)的影響 ERK、p38MAPK和NF-κB抑制劑顯著下調(diào)ECV-304細(xì)胞ICAM-1 mRNA的表達(dá)，見表3。

圖2 不同劑量EMPs作用后ECV-304細(xì)胞p-ERK、p-p38MAPK及NF-κB p65蛋白的表達(dá)

表2 EMPs不同劑量作用后ECV-304細(xì)胞p-ERK、p-p38MAPK、NF-κB p65蛋白及ICAM-1 mRNA的表達(dá)

表3 抑制劑預(yù)處理后EMPs誘導(dǎo)的ECV-304細(xì)胞ICAM-1 mRNA的表達(dá)(n=6)

2.4 阿托伐他汀對(duì)EMPs誘導(dǎo)的ECV-304細(xì)胞p-ERK、p-p38MAPK、NF-κB p65蛋白及ICAM-1 mRNA表達(dá)的影響 見表4?？梢钥闯?，10 μmol/L阿托伐他汀可顯著抑制EMPs誘導(dǎo)的ECV-304細(xì)胞p-ERK、p-p38MAPK和NF-κB p65蛋白及ICAM-1 mRNA的表達(dá)。

表4 阿托伐他汀預(yù)處理后EMPs誘導(dǎo)的ECV-304細(xì)胞ICAM-1 mRNA的表達(dá)(n=6)

3 討論

EMPs是血管內(nèi)皮細(xì)胞在各種刺激作用下激活或凋亡后釋放的小囊泡［1］。在動(dòng)脈粥樣硬化血栓形成疾病中，EMPs可以作為血管損傷的標(biāo)志物，是心血管疾病死亡率和主要不良心血管事件的潛在預(yù)測(cè)指標(biāo)［7］。更為重要的是，EMPs表面攜帶有起源細(xì)胞的膜蛋白類和磷脂類物質(zhì)，具有一定的內(nèi)皮細(xì)胞抗原特性，因此EMPs也是一種生物活性物質(zhì)和信息攜帶體，可發(fā)揮生物效應(yīng)和參與細(xì)胞信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)［8］。研究［9］表明，EMPs通過抑制NO的合成，損害血流介導(dǎo)性血管擴(kuò)張，增加脈搏波速度。此外，EMPs也可以促進(jìn)局部細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致新的EMPs的形成和釋放，從而導(dǎo)致惡性循環(huán)。

動(dòng)脈粥樣硬化是慢性炎性和免疫性疾病，單核細(xì)胞等炎性細(xì)胞通過黏附分子的介導(dǎo)，黏附于內(nèi)皮細(xì)胞并進(jìn)入動(dòng)脈內(nèi)膜，是動(dòng)脈粥樣硬化形成的始動(dòng)環(huán)節(jié)。ICAM-1則是這些黏附分子中最重要的一種。EMPs不但可以作為動(dòng)脈粥樣硬化內(nèi)皮功能障礙的標(biāo)志物，還可進(jìn)一步導(dǎo)致內(nèi)皮損傷，上調(diào)黏附分子的表達(dá)，促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)展［8］。該研究結(jié)果也證實(shí)，EMPs可以刺激HUVEC細(xì)胞ICAM-1 mRNA的表達(dá)，且呈劑量和時(shí)間依賴性。因此，EMPs作為一種效應(yīng)物質(zhì)，可能參與動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生和發(fā)展過程。

ERK、p38MAPK和NF-κB是介導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞炎性反應(yīng)和炎性因子表達(dá)的重要信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路［4］。通常認(rèn)為NF-κB是ERK和p38MAPK的下游信號(hào)分子，它是將信息從胞質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)至胞核，引起相應(yīng)基因表達(dá)的最終信號(hào)通路和重要轉(zhuǎn)錄因子。既往眾多研究［4］表明，多種刺激物可通過上述信號(hào)通路誘導(dǎo)HUVEC上調(diào)ICAM-1表達(dá)。該研究結(jié)果顯示，單獨(dú)應(yīng)用ERK、p38MAPK及NF-κB特異性抑制劑均可部分地抑制EMPs誘導(dǎo)HUVEC ICAM-1的表達(dá)，提示EMPs誘導(dǎo)HUVEC上調(diào)ICAM-1的表達(dá)需要ERK和p38MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的參與，同時(shí)在EMPs誘導(dǎo)的HUVEC活化和炎性反應(yīng)過程中NF-κB介導(dǎo)的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)也發(fā)揮了重要作用。

既往研究［5］表明，阿托伐他汀除了具有調(diào)脂作用外，還具有抑制內(nèi)皮炎癥，保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞，延緩動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)展，穩(wěn)定斑塊的作用。該研究結(jié)果表明，阿托伐他汀可以明顯抑制EMPs誘導(dǎo)的HUVEC細(xì)胞 ICAM-1mRNA表達(dá)上調(diào)，下調(diào) ERK、p38MAPK、核蛋白NF-κB p65的磷酸化水平。提示阿托伐他汀抑制內(nèi)皮炎癥，延緩動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)展和穩(wěn)定斑塊的作用可能與抑制EMPs對(duì)血管內(nèi)皮的損傷和刺激有關(guān)。

綜上所述，EMPs通過ERK、p38MAPK和NF-κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路誘導(dǎo)HUVEC表達(dá)ICAM-1。阿托伐他汀主要通過上述信號(hào)通路抑制EMPs誘導(dǎo)的內(nèi)皮炎癥。

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Effects of atorvastatin on expressions of ERK，p38MAPK，NF-κB proteins and ICAM-1 mRNA in HUVECs induced by endothelial microparticles

LU Yongguang，F(xiàn)U Chunhui，YAN Hua，CHEN Xianggui，HUANG Junzhang，CHEN Liyuan Department of Cardiology，the Second People’s Hospital of Qinzhou，Qinzhou 535099

endothelial microparticle;human umbilical vein endothelial cell;mitogen-activated protein kinase;intercellular adhesion molecule 1;atorvastatin

Aim:To observe the effects of atorvastatin on ERK，p38MAPK and nuclear factor-κB(NF-κB)and intercellular adhesion molecule 1(ICAM-1)expressions in endothelial microparticles(EMPs)-induced human umbilical vein endothelial cells(HUVECs).Methods:The cultured HUVECs were cultured with EMPs of 105mL－1for 0，3，6，12，and 24 h.The HUVECs were cultured with 0，102，103，104，105mL－1EMPs for 24 h.The HUVECs were pretreated with ERK inhibitor(PD98059)，p38 inhibitor(SB203580)，NF-κB inhibitor(PDTC)，or atorvastatin，then were treated with EMPs.The ICAM-1 mRNA level was detected by Real-time-PCR.Western blot was performed to determine the expression levels of phospho-ERK(p-ERK)，p-p38MAPK and NF-κB p65 proteins.Results:With the increase of dose and exposure time of EMPs，the expression levels of ICAM-1 mRNA，p-ERK，p-p38MAPK and NF-κB p65 protein in HUVECs obviously increased(P＜0.001).After the pretreatment of the inhibitors mentioned above and atorvastatin，the ICAM-1 mRNA expression decreased(P＜0.05).Conclusion:Atorvastatin could downregulate ICAM-1 expression in EMPs-induced HUVECs by blocking ERK/MAPK and NF-κB signaling pathway.

R543.3

10.3969/j.issn.1671-6825.2012.06.006*廣西自然科學(xué)基金青年基金資助項(xiàng)目 2012GXNSFBA053113;廣西衛(wèi)生廳自籌經(jīng)費(fèi)科研項(xiàng)目 Z2011103

(2012-02-05收稿 責(zé)任編輯王 曼)