韓艷林，翟明霞，吳亞紅，高艷鋒，祁元明

鄭州大學(xué)生物工程系鄭州 450001

#通訊作者，女，1957年1月生，博士，教授，研究方向:抗原肽和多肽疫苗，E-mail:qym@zzu.edu.cn

腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)基因1 HLA-A3限制性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞表位的預(yù)測與鑒定

韓艷林，翟明霞，吳亞紅，高艷鋒，祁元明#

鄭州大學(xué)生物工程系鄭州 450001

#通訊作者，女，1957年1月生，博士，教授，研究方向:抗原肽和多肽疫苗，E-mail:qym@zzu.edu.cn

腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)基因1;HLA-A3;細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞

目的:鑒定腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)基因1(MTA1)的HLA-A3限制性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)表位。方法:首先運(yùn)用RT-PCR方法檢測MTA1 mRNA在腫瘤細(xì)胞系EC-1、EC-109和T-47D中的表達(dá)情況。然后通過BIMAS、SYFPEITHI、NetCTL 1.2及IEDB 4個(gè)軟件預(yù)測篩選MTA1 HLA-A3限制性的候選表位。候選表位通過標(biāo)準(zhǔn)Fmoc化學(xué)法合成，通過結(jié)合力實(shí)驗(yàn)檢測表位與T2A3細(xì)胞表面HLA-A3分子的結(jié)合力水平，通過體外細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)檢測候選肽誘導(dǎo)CTL的能力。結(jié)果:MTA1 mRNA在EC-1、EC-109和T-47D細(xì)胞中均有表達(dá)。候選表位P130與HLA-A3分子有弱結(jié)合力，P294、P559與HLA-A3分子有中等結(jié)合力。細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示多肽P130、P294和P559對EC-1細(xì)胞均有一定的殺傷作用(F細(xì)胞=176.107，F(xiàn)效靶比=48.306，F(xiàn)交互=35.686，P均＜0.001)。結(jié)論:多肽P130、P294、P559能夠誘導(dǎo)體外抗腫瘤免疫反應(yīng)，可能成為新的抗腫瘤多肽疫苗的候選表位。

腫瘤的免疫治療通過激發(fā)和增強(qiáng)機(jī)體的免疫功能來控制和殺死腫瘤細(xì)胞，而腫瘤治療性多肽疫苗則是腫瘤免疫治療的一個(gè)重要方向。新的腫瘤相關(guān)抗原的發(fā)現(xiàn)及相應(yīng)細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(cytotoxic T lymphocyte，CTL)表位的鑒定推動(dòng)了多肽疫苗的發(fā)展［1-2］。腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)基因1(metastasis associated gene 1，MTA1)是1994年Toh等［3］在人乳癌細(xì)胞中鑒定發(fā)現(xiàn)的。研究［4］發(fā)現(xiàn)它在多種轉(zhuǎn)移性腫瘤組織中過表達(dá)，如乳癌、食管癌、胃癌、肝癌等，而在正常組織中低表達(dá)或不表達(dá)，并且其在腫瘤組織中的表達(dá)水平與其轉(zhuǎn)移或浸潤潛能顯著相關(guān)。另外，我國有超過50%的人群表達(dá)HLA-A3。該研究尋找并鑒定MTA1的HLA-A3限制性CTL表位，并通過細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)檢測其殺傷力，為進(jìn)一步對腫瘤的免疫治療奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與試劑 T2A3細(xì)胞系、食管癌細(xì)胞系EC-1(HLA-A3+)和EC-109(HLA-A3+)以及乳癌細(xì)胞系T-47D(HLA-A3+)由鄭州大學(xué)生物工程系多肽生化實(shí)驗(yàn)室常規(guī)保存，于37℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2飽和濕度培養(yǎng)條件下常規(guī)培養(yǎng)。外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMCs)由HLA-A3+健康供者捐贈(zèng)。RPMI 1640培養(yǎng)基(Invitrogen公司)，胎牛血清(杭州四季青公司)。

1.2 腫瘤細(xì)胞中MTA1 mRNA的檢測 采用RTPCR法檢測MTA1 mRNA在EC-1、EC-109以及T-47D細(xì)胞中的表達(dá)。MTA1引物序列:上游 5’-AGCTACGAGCAGCACAACGGGGT-3’，下游5’-CAC GCTTGGTTTCCGAGGAT-3’，產(chǎn)物大小289 bp。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.3 HLA-A3限制性CTL表位的預(yù)測與合成 結(jié)合BIMAS、SYFPEITHI、NetCTL 1.2及IEDB軟件對MTA1氨基酸序列的預(yù)測打分，選出綜合打分較好的HLA-A3限制性表位。候選肽采用標(biāo)準(zhǔn)Fmoc方法合成，經(jīng)HPLC純化后，其純度＞95%，質(zhì)譜分析其相對分子質(zhì)量符合理論值。

1.4 候選表位的鑒定

1.4.1 表位肽與HLA-A3分子結(jié)合力實(shí)驗(yàn) 收集T2A3細(xì)胞，用無血清RPMI 1640培養(yǎng)基洗2次，調(diào)整細(xì)胞濃度至1×109L－1，1 mL/孔，每孔加入待測肽50 mg/L、β2微球蛋白(β2-M)2.5 mg/L，37℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2共孵育18 h后，冷PBS洗滌3次，加入100 μL稀釋100倍的鼠抗人β2-M一抗，4℃靜置30 min。冷PBS洗滌3次，加入50 μL稀釋50倍的FITC-羊抗鼠二抗，4℃放置40 min，PBS洗滌后用流式細(xì)胞儀檢測。其結(jié)果用熒光系數(shù)(FI)表示:FI= (表位肽平均熒光強(qiáng)度－背景平均熒光強(qiáng)度)/背景平均熒光強(qiáng)度。FI＞1.0表示高結(jié)合力，1.0≥FI≥0.5表示中等結(jié)合力，F(xiàn)I＜0.5表示低結(jié)合力。

1.4.2 CTL的體外誘導(dǎo)及靶細(xì)胞的制備 PBMCs

用含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的IMDM培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度為1×109L－1。第2天分別加入10 mg/L的候選肽共培養(yǎng)，陰性對照組加入10 μL的PBS，無關(guān)肽組加入10 mg/L的HBcAg18-27(FLPSDFFPSV)第3天加入5×104U/L的rIL-2繼續(xù)培養(yǎng)。每周收集細(xì)胞，800 r/min離心10 min，除去上清，加入新鮮的含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的IMDM培養(yǎng)基，同時(shí)加入上述條件的候選肽和rIL-2。刺激3輪后于最后一次刺激的第3天收集細(xì)胞作為效應(yīng)細(xì)胞。胰蛋白酶消化EC-1細(xì)胞作為靶細(xì)胞。

1.4.3 細(xì)胞毒活性檢測 調(diào)整效應(yīng)細(xì)胞濃度為5× 109L－1，調(diào)整靶細(xì)胞濃度為 1×108L－1，分別按50∶1、25∶1、12.5∶1的效靶比鋪于96孔板中，同時(shí)設(shè)立效應(yīng)細(xì)胞自發(fā)釋放組、靶細(xì)胞自發(fā)釋放組、靶細(xì)胞最大釋放組、體積校正組和背景對照組，每孔終體積為100 μL，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。于37℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2條件下培養(yǎng)4 h。于孵育結(jié)束前45 min，在靶細(xì)胞最大釋放組及體積校正組中加入10 μL裂解液。1 000 r/min離心4 min，轉(zhuǎn)移50 μL上清至另一96孔板中，每孔加入50 μL底物混合液，室溫避光孵育30 min;再加入50 μL/孔終止液。用酶標(biāo)儀檢測其在490 nm波長處的吸光度(A)值。殺傷率=(實(shí)驗(yàn)孔A值－CTL自發(fā)釋放值－靶細(xì)胞自發(fā)釋放值)/(靶細(xì)胞最大釋放值－靶細(xì)胞自發(fā)釋放值)×100%。

2 結(jié)果

2.1 腫瘤細(xì)胞中MTA1 mRNA的表達(dá) MTA1在

3種腫瘤細(xì)胞系中均有表達(dá)。見圖1。

圖1 腫瘤細(xì)胞中MTA1 mRNA的表達(dá)

2.2 MTA1 HLA-A3限制性CTL表位的預(yù)測結(jié)果 根據(jù)BIMAS(分值均大于10)、SYFPEITHI(分值均大于20)、NetCTL 1.2(分值均大于1.0)及IEDB(分值均小于1.0)軟件預(yù)測結(jié)果篩選出分值較好的CTL表位，共5條九肽。見表1。

表1 MTA1 HLA-A3限制性CTL表位預(yù)測和結(jié)合力實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3 表位肽與HLA-A3分子結(jié)合力實(shí)驗(yàn)結(jié)果 見表1。P130、P353、P670具有弱結(jié)合力，P294、P559具有中等結(jié)合力。

2.4 細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)結(jié)果 見表2。

表2 P130、P294和P559誘導(dǎo)的CTL對EC-1的殺傷率(n=3) %

3 討論

腫瘤轉(zhuǎn)移是一個(gè)涉及多種原因及其產(chǎn)物的復(fù)雜過程，包括腫瘤細(xì)胞從原發(fā)灶脫離，侵入淋巴管、血管及周圍組織，誘導(dǎo)血管形成，逃避宿主細(xì)胞抗腫瘤反應(yīng)和在轉(zhuǎn)移部位生長［5-6］，了解腫瘤轉(zhuǎn)移所涉及的基因和基因產(chǎn)物是目前國內(nèi)外研究的熱題。作者的研究結(jié)果表明MTA1 mRNA在EC-1、EC-109和T-47D細(xì)胞中均有表達(dá)，提示以上3種細(xì)胞均可作為殺傷實(shí)驗(yàn)的靶細(xì)胞。

BIMAS、SYFPEITHI、NetCTL 1.2及IEDB是預(yù)測抗原表位肽的常用預(yù)測軟件。BIMAS和IEDB預(yù)測的重點(diǎn)在于表位肽與HLA分子結(jié)合的親和力和穩(wěn)定性，SYFPEITHI是基于超基序的經(jīng)典預(yù)測工具，而NetCTL 1.2則綜合了表位肽與HLA分子的結(jié)合力、蛋白酶體降解以及轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)蛋白呈遞效率這些方面來預(yù)測表位［7］。這些軟件主要從MHC分子與表位肽的結(jié)合環(huán)節(jié)來預(yù)測其結(jié)合能力，從而篩選親和力較高的表位肽［8］。然而也有研究［9］表明并非所有與MHC分子有高親和力的表位肽都能有效激發(fā)出特異性CTL。有研究［10］報(bào)道，用高親和力的表位肽激發(fā)CTL產(chǎn)生抗腫瘤效應(yīng)的同時(shí)，有發(fā)生自身免疫疾病的可能。而低親和力的多肽疫苗也可以在體內(nèi)誘導(dǎo)有效應(yīng)能力的CTL，并且避免了自身免疫疾病的發(fā)生。該研究中，作者結(jié)合了幾種預(yù)測軟件篩選出9個(gè)表位，通過結(jié)合力實(shí)驗(yàn)最終選擇了兩條具有中等結(jié)合力的表位肽P294、P559和一條低結(jié)合力的表位肽P130。3條肽均體外誘導(dǎo)出了特異性CTL，并對腫瘤細(xì)胞有一定的殺傷作用，提示3條肽均有較好的免疫原性。該研究結(jié)果顯示，隨著效靶比增大，殺傷效果也增強(qiáng)。特別是低結(jié)合力的表位肽P130，其殺傷效果在50∶1時(shí)比另兩條肽略好，這也說明低親和力的表位肽有潛力誘導(dǎo)具有效應(yīng)能力的CTL［11-12］。

該研究鑒定了3條來源于MTA1的表位P130、P294和P559，在體外細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)中所誘導(dǎo)的CTL對靶細(xì)胞EC-1均具有殺傷作用且殺傷效果較強(qiáng)。下一步會(huì)考慮在已鑒定的CTL表位的基礎(chǔ)上嘗試長肽疫苗、多表位融合疫苗及蛋白疫苗等的研究。

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Identification of HLA-A3 restricted cytotoxic T lymphocyte epitopes from metastasis associated gene 1

HAN Yanlin，ZHAI Mingxia，WU Yahong，GAO Yanfeng，QI Yuanming Department of Bioengineering，Zhengzhou University，Zhengzhou 450001

metastasis associated gene 1;HLA-A3;cytotoxic T lymphocyte

Aim:To identify the HLA-A3 restricted cytotoxic T lymphocyte(CTL)epitopes from metastasis associated gene 1(MTA1).Methods:RT-PCR was used to determine the expression of MTA1 mRNA in cancer cell lines，EC-1，EC-109 and T-47D.HLA-A3 epitopes from MTA1 protein were predicted by BIMAS，SYFPEITHI，NetCTL 1.2 and IEDB.Peptides were synthesized by standard Fmoc chemistry method.Their binding affinities towards HLA-A3 molecule were evaluated by T2A3 cells binding assay.Their ability to induce T cell response was investigated by using cytotoxicity assay in vitro.Results: The expression of MTA1 mRNA was observed in EC-1，EC-109 and T-47D cells.The candidate peptide P130 showed weak affinity towards HLA-A3 molecule，while P294 and P559 showed moderate affinity.The CTLs induced by all the three peptides could lyse EC-1 cells(Fcell=176.107，F(xiàn)ratio=48.306，F(xiàn)interaction=35.686，P＜0.001).Conclusion:The peptides P130，P294，and P559 could induce anti-tumor inmmunity in vitro and serve as candidates towards antitumor peptide vaccines.

Q279

10.3969/j.issn.1671-6825.2012.06.008*國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目 81172893，30901362;鄭州大學(xué)研究生科學(xué)研究基金資助項(xiàng)目 11L00403

(2012-03-06收稿 責(zé)任編輯李沛寰)