杜軍波，于建斌，黃建敏，張江安，苗 青，張 斌，張 毅

1)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院皮膚科鄭州 450052 2)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院生物細(xì)胞治療中心鄭州 450052 3)鄭州大學(xué)生物工程系鄭州 450001 4)河南省高等學(xué)校臨床醫(yī)學(xué)重點(diǎn)學(xué)科開放實(shí)驗(yàn)室鄭州450052

#通訊作者，于建斌，男，1962年5月生，博士，教授，主任醫(yī)師，研究方向:皮膚腫瘤與色素性皮膚病，E-mail:yjbdoctor@sina.com;張毅，男，1964年4月生，博士，教授，研究方向:腫瘤免疫及生物治療，E-mail:chyizhang@gmail.com

白癜風(fēng)患者外周血T淋巴細(xì)胞CD28、CTLA-4的表達(dá)*

杜軍波1，2)，于建斌1)#，黃建敏2)，張江安1)，苗 青1)，張 斌2)，張 毅2，3，4)#

1)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院皮膚科鄭州 450052 2)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院生物細(xì)胞治療中心鄭州 450052 3)鄭州大學(xué)生物工程系鄭州 450001 4)河南省高等學(xué)校臨床醫(yī)學(xué)重點(diǎn)學(xué)科開放實(shí)驗(yàn)室鄭州450052

#通訊作者，于建斌，男，1962年5月生，博士，教授，主任醫(yī)師，研究方向:皮膚腫瘤與色素性皮膚病，E-mail:yjbdoctor@sina.com;張毅，男，1964年4月生，博士，教授，研究方向:腫瘤免疫及生物治療，E-mail:chyizhang@gmail.com

白癜風(fēng);T淋巴細(xì)胞;CD28;CTLA-4

目的:檢測(cè)白癜風(fēng)患者外周血T淋巴細(xì)胞CD28、CTLA-4的表達(dá)情況。方法:選擇白癜風(fēng)患者20例(進(jìn)展期10例，穩(wěn)定期10例)和健康對(duì)照10例，密度梯度離心法分離外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)后，應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面CD28、CTLA-4的表達(dá)。結(jié)果:3組外周血CD8+T細(xì)胞CD28的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=1.187，P=0.320)，但外周血CD3+和CD4+T細(xì)胞CD28和CTLA-4的表達(dá)、以及CD8+T細(xì)胞CTLA-4的表達(dá)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=5.132、6.963、4.927、8.751和5.219，P均＜0.05)。與對(duì)照組相比，進(jìn)展期組CD3+和CD4+T細(xì)胞CD28的表達(dá)及CD8+T細(xì)胞CTLA-4的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，而CD3+和CD4+T細(xì)胞CTLA-4的表達(dá)降低(P＜0.05);穩(wěn)定期組CD3+和CD4+T細(xì)胞CTLA-4的表達(dá)與對(duì)照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，但CD3+和CD4+T細(xì)胞CD28的表達(dá)明顯降低(P＜0.05)。結(jié)論:白癜風(fēng)患者外周血T淋巴細(xì)胞上CD28、CTLA-4表達(dá)異常，可能與患者免疫功能紊亂及疾病發(fā)生發(fā)展有關(guān)。

白癜風(fēng)是一種自身免疫性疾病，其發(fā)病機(jī)制至今尚不十分清楚，但T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫異常是研究的重點(diǎn)之一，而T淋巴細(xì)胞和抗原提呈細(xì)胞(antigen presenting cell，APC)的異?；罨徽J(rèn)為是導(dǎo)致免疫紊亂的基礎(chǔ)。共刺激分子CD28屬于免疫球蛋白超家族，在免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用。APC上的B7與T細(xì)胞上相應(yīng)的受體CD28結(jié)合，向T細(xì)胞提供活化的第二信號(hào)(共刺激信號(hào))，可增強(qiáng)T細(xì)胞的活化及增殖［1］。細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原4 (cytotoxic T lymphocyte-associated antigen-4，CTLA-4)是T細(xì)胞上的一種跨膜受體，與CD28共同享有B7分子配體，而CTLA-4與B7分子結(jié)合后誘導(dǎo)T細(xì)胞無反應(yīng)性，參與免疫反應(yīng)的負(fù)性調(diào)節(jié)。國內(nèi)外對(duì)外周血T淋巴細(xì)胞CD28、CTLA-4的檢測(cè)多是應(yīng)用于系統(tǒng)性紅斑狼瘡、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎以及其他自身免疫性疾病［2-4］，而針對(duì)白癜風(fēng)的研究尚未見報(bào)道。因此作者對(duì)白癜風(fēng)患者外周血T淋巴細(xì)胞CD28、CTLA-4的表達(dá)進(jìn)行了檢測(cè)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 20例白癜風(fēng)患者均為2011年鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院皮膚科門診確診病例，患者均無其他免疫系統(tǒng)疾病，檢測(cè)前1個(gè)月內(nèi)未接受過任何免疫治療。其中男8例，女12例，年齡18～33 (28.2±8.5)歲。按照中國中西醫(yī)結(jié)合學(xué)會(huì)皮膚性病專業(yè)委員會(huì)色素病學(xué)組2003年修定的白癜風(fēng)臨床分型及療效標(biāo)準(zhǔn)［5］分為進(jìn)展期10例和穩(wěn)定期10例。另選取同期體檢健康者10例為對(duì)照，其中男4例，女6例，年齡21～29(24.5±7.4)歲。

1.2 外周血T淋巴細(xì)胞CD28、CTLA-4的檢測(cè)

無菌條件下抽取入選對(duì)象晨起空腹外周靜脈血10 mL，肝素抗凝，密度梯度離心法分離單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)，用50 mL PBS洗滌2次備用。將新分離的PBMC重懸于100 μL PBS中，分別與2 μL熒光素標(biāo)記的小鼠抗人CD3、CD4、CD8、CD28、CTLA-4單抗或小鼠IgG對(duì)照球蛋白在4℃條件下避光孵育15 min，PBS洗滌2次，重懸于500 μL PBS中，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。FITC標(biāo)記的鼠抗人CD4、CD8單抗，PE標(biāo)記的鼠抗人CD3單抗，APC標(biāo)記的CD28、CTLA-4單抗，以及相應(yīng)的鼠抗人 IgG-PE抗體、IgG-FITC抗體、IgGAPC抗體均為美國BD公司產(chǎn)品。流式儀檢測(cè)時(shí)，以前向散射“開窗”于淋巴細(xì)胞，根據(jù)同型對(duì)照調(diào)節(jié)各熒光的光電倍增管電壓，顏色補(bǔ)償設(shè)定在允許范圍內(nèi)。每份樣本收集10 000個(gè)PBMC，分析CD3、CD4、CD8、CD28、CTLA-4的表達(dá)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 17.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，3組外周血T細(xì)胞CD28、CTLA-4表達(dá)水平的比較采用單因素方差分析及LSD-t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

3組外周血T細(xì)胞CD28、CTLA-4的表達(dá)情況見表1、表2。

表13 組外周血T細(xì)胞CD28的表達(dá)情況 %

表23 組外周血T細(xì)胞CTLA-4的表達(dá)情況 %

3 討論

CD28與CTLA-4是一對(duì)具有正負(fù)調(diào)節(jié)功能的共刺激分子，它們的天然配體為存在于APC表面的B7分子家族。前者提供T細(xì)胞活化信號(hào)，后者提供反饋性免疫負(fù)性調(diào)節(jié)信號(hào)［6］，兩者在T細(xì)胞激活的始動(dòng)階段就發(fā)揮重要作用。CD28是最早被證實(shí)的共刺激分子，它以同型二聚體的形式主要表達(dá)于CD4+和CD8+T細(xì)胞表面。CTLA-4又名CD152，也是免疫球蛋白超家族成員之一，是T細(xì)胞上的一種跨膜受體，與CD28共同享有B7分子配體。CD28與CTLA-4競(jìng)爭(zhēng)性地與B7分子結(jié)合，發(fā)揮相應(yīng)的免疫學(xué)效應(yīng)。CD28與相應(yīng)配體結(jié)合后，傳導(dǎo)第二信號(hào)，可增強(qiáng)T細(xì)胞的活化及增殖。T細(xì)胞激活后，CTLA-4表達(dá)迅速上調(diào)，競(jìng)爭(zhēng)性地與APC上的B7分子結(jié)合，阻斷CD28分子作用，起到抑制或終止免疫反應(yīng)的作用［7］。

白癜風(fēng)作為一種自身免疫性疾病，有兩個(gè)主要的發(fā)病機(jī)制，一是T細(xì)胞介導(dǎo)的，一是抗體介導(dǎo)的［8］，其中T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫尤為重要。國內(nèi)外研究［9-10］發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的黑色素細(xì)胞的破壞與白癜風(fēng)的發(fā)展密切相關(guān)。因此，了解T淋巴細(xì)胞表面與免疫反應(yīng)相關(guān)的生物標(biāo)志的表達(dá)情況，對(duì)白癜風(fēng)發(fā)病機(jī)制的研究有重要意義。

研究［11］發(fā)現(xiàn)，晚期宮頸癌患者外周血 CD4+、CD8+T細(xì)胞上CD28的表達(dá)量低于健康對(duì)照組，而且T細(xì)胞上CTLA-4的表達(dá)明顯升高，提示晚期宮頸癌患者T細(xì)胞免疫受到的抑制與CD28及CTLA-4的表達(dá)失調(diào)密切相關(guān)。CTLA-4基因敲除小鼠出生3～4周后淋巴結(jié)體積增大為對(duì)照組的8倍，淋巴細(xì)胞數(shù)為對(duì)照組的5～10倍，骨髓、肝、肺、心臟和胰腺出現(xiàn)彌漫或局灶性T細(xì)胞浸潤，外周血T淋巴細(xì)胞大量增殖，說明CTLA-4在正常T淋巴細(xì)胞增殖、活化中起著重要的抑制作用，是機(jī)體維持淋巴細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)［12］。

該研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，白癜風(fēng)患者進(jìn)展期CD3+和CD4+T淋巴細(xì)胞上CD28分子的表達(dá)無明顯差異，而起負(fù)性調(diào)節(jié)作用的CTLA-4的表達(dá)則有所降低，提示在白癜風(fēng)進(jìn)展過程中，免疫抑制作用減弱，使得免疫反應(yīng)相對(duì)亢進(jìn)，導(dǎo)致了疾病的進(jìn)一步發(fā)展。在臨床上，部分患者發(fā)生白癜風(fēng)后未經(jīng)免疫治療，皮損不再擴(kuò)大，進(jìn)入穩(wěn)定期。臨床上也有很多白癜風(fēng)患者的皮損呈持續(xù)發(fā)展?fàn)顟B(tài)，稱為進(jìn)展期。白癜風(fēng)進(jìn)入進(jìn)展期，說明這些患者體內(nèi)過激的免疫反應(yīng)未得到自身的有效調(diào)節(jié)。該研究結(jié)果顯示，與進(jìn)展期相比，白癜風(fēng)穩(wěn)定期患者T淋巴細(xì)胞上CD28分子的表達(dá)下調(diào)，表明過激的細(xì)胞免疫已經(jīng)受到自身某些因素的抑制，而穩(wěn)定期CTLA-4的表達(dá)與進(jìn)展期相比無明顯差異，這與文獻(xiàn)［6］報(bào)道不一致。這種現(xiàn)象的出現(xiàn)是否只和白癜風(fēng)相關(guān)，還是由其他因素所致，需要深入研究。

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Expressions of CD28 and CTLA-4 in peripheral blood T cells of patients with vitiligo

DU Junbo1，2)，YU Jianbin1)，HUANG Jianmin2)，ZHANG Jiang’an1)，MIAO Qing1)，ZHANG Bin2)，ZHANG Yi2，3，4)1)Department of Dermatology，the First Affiliated Hospital，Zhengzhou University，Zhengzhou 4500522)Biotherapy Center，the First Affiliated Hospital，Zhengzhou University，Zhengzhou 450052 3)Department of Bioengineering，Zhengzhou University，Zhengzhou 450001 4)Key Disciplines Laboratory for Clinical Medicine of Henan Province，Zhengzhou 450052

vitiligo;T lymphocyte;CD28;CTLA-4

Aim:To detect the expressions of CD28 and CTLA-4 in peripheral blood T cells of patients with vitiligo.Methods:Twenty vitiligo patients including 10 cases of progressive stage and 10 cases of stationary stage，and 10 normal individuals served as controls were subjected to isolated peripheral blood mononuclear cells(PBMC)by density gradient centrifugation.The expressions of CD28 and CTLA-4 in T cells were detected using flow cytometry.Results:There were significant differences in the expressions of CD28 and CTLA-4 in CD3+T cells，CD4+T cells，and CTLA-4 in CD8+T cells among the three groups(F=5.132，6.963，4.927，8.751，and 5.219，P＜0.05)，but not in the expressions of CD28 in CD8+T cells(F=1.187，P=0.320).Compared with those of the control group，the expressions of CD28 in CD3+T cells and CD4+T cells，and CTLA-4 in CD8+T cells in progressive stage vitiligo group were not significantly different(P＞0.05)，but those of CTLA-4 in CD3+T cells and CD4+T cells were lower(P＜0.05);the expressions of CTLA-4 in CD3+T cells and CD4+T cells in stationary stage vitiligo group were not statistically different(P＞0.05)，but those of CD28 in CD3+T cells and CD4+T cells were lower(P＜0.05).Conclusion:The abnormal expressions of CD28，CTLA-4 in peripheral blood T cells in patients with vitiligo may induce functional disorders of costimulatory molecules，and may be relevant to the occurrence and development of vitiligo.

R758.4

10.3969/j.issn.1671-6825.2012.06.009*國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目 81171986;河南省衛(wèi)生廳重大科技攻關(guān)基金資助項(xiàng)目 20110110001，河南省科技廳基礎(chǔ)與前沿技術(shù)研究基金資助項(xiàng)目 112300410153

(2012-03-13收稿 責(zé)任編輯王 曼)