王 輝，陳來喜，肖愛鳳，李洪武

（海南大學(xué) 海洋學(xué)院，海南 海口 570228）

氮和鐵對(duì)小球藻和微擬球藻油脂積累的影響

王 輝，陳來喜，肖愛鳳，李洪武*

（海南大學(xué) 海洋學(xué)院，海南 ?？?570228）

以在海南分離的藻株小球藻HNC1（Chlorella sp.HNC1）和微擬球藻HNN1（Nannochloropsis sp.HNN1）為材料，研究N和Fe3+對(duì)細(xì)胞油脂積累的影響.結(jié)果表明：N缺乏條件促進(jìn)了小球藻和微擬球藻細(xì)胞的油脂積累，但對(duì)生長有抑制作用.與對(duì)照相比，培養(yǎng)基中Fe3+的缺乏抑制了小球藻的生長和油脂的積累；Fe3+缺乏對(duì)微擬球藻的油脂積累有抑制作用；但對(duì)其生長無明顯影響.富Fe3+處理對(duì)小球藻的油脂積累具有刺激作用，但對(duì)微擬球藻無顯著影響；富Fe3+和正常鐵條件下小球藻和微擬球藻的生長無顯著差異.

旅小球藻；微擬球藻；油脂積累；生長狀態(tài)；鐵；氮

由于化石能源的日趨減少以及大量地使用化石能源造成的環(huán)境污染的不斷加劇，以動(dòng)植物為原料的生物柴油的開發(fā)和應(yīng)用再次受到廣泛關(guān)注.在各種可再生能源的資源中，微藻具有生長速度快、生物質(zhì)產(chǎn)量高和含油量高等特點(diǎn).全球石油俱樂部（Global Petroleum Club）的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)表明，微藻油脂的單位年產(chǎn)量是油棕的15倍，大豆的75倍，油菜籽的200倍[2].其次是微藻，尤其是海水種的，培養(yǎng)不與農(nóng)業(yè)爭(zhēng)耕地和淡水、不影響食物安全保障和破壞生境等多方面優(yōu)勢(shì)而引人矚目,微藻生物柴油成為目前人們關(guān)注的熱點(diǎn)話題之一[1-3].

許多研究結(jié)果表明大部分藻類在營養(yǎng)脅迫的條件下能積累更高含量的油脂，但營養(yǎng)缺乏又會(huì)降低藻體的生長速度，因此在實(shí)際生產(chǎn)中要使油脂產(chǎn)量最高以致是成本達(dá)到較低水平，就必須在微藻總生物量和細(xì)胞油脂含量間尋求平衡.微藻油脂的含量隨微藻種類的不同而差異懸殊.影響微藻油脂積累的因素有很多，研究結(jié)果表明：缺氮處理可以提高微藻細(xì)胞的油脂含量，某些單細(xì)胞微藻可大量積累油脂，含油量甚至可高達(dá)60%[4-5]，同時(shí)有研究發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)液中高濃度的FeCl3對(duì)海水小球藻（Chlorel?la vulgaris）的油脂積累有明顯的促進(jìn)作用，可使其質(zhì)量分?jǐn)?shù)高達(dá)干質(zhì)量的56.6%[6]，因此作者以從?？诮：Ｓ蛑蟹蛛x獲得的兩珠綠藻——小球藻（Chlorellasp.）HNC1和微擬球藻（Nannochloropsissp.）HNN1為研究對(duì)象，研究了缺N、缺鐵、富鐵三種特殊處理對(duì)其細(xì)胞生長狀態(tài)和油脂積累的影響.

1 材料與方法

1.1 藻種與培養(yǎng)

野外水樣采自?？谥苓吅Ｓ?，對(duì)水樣中的微藻進(jìn)行分離、純化.藻種篩選及培養(yǎng)在恒溫震蕩培養(yǎng)箱中（轉(zhuǎn)速130 rpm/min），用不加Si的F/2培養(yǎng)基[7]（記為f/2-Si），培養(yǎng)溫度約為26±2℃，光照強(qiáng)度約8000～10000 Lx，光暗比為14h∶10h.

1.2 分析方法

1.2.1 生長測(cè)定

用可見分光光度計(jì)（722型）測(cè)定藻液在500 nm處的吸光值，根據(jù)公式y(tǒng)=2×107x計(jì)算細(xì)胞數(shù)[8].1.2.2總脂含量測(cè)定

油脂積累的測(cè)定，脂質(zhì)與尼羅紅熒光染色溶液結(jié)合能發(fā)出熒光檢測(cè)信號(hào)，脂質(zhì)的量與熒光強(qiáng)度成正比可以快速、可靠地測(cè)定活體細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)的量.研究結(jié)果表明，經(jīng)尼羅紅染色后的小球藻在480 nm光激發(fā)下，位于580 nm的熒光峰的強(qiáng)度與稱質(zhì)量法測(cè)定的總脂含量呈線性正相關(guān)[6-11].因此，本實(shí)驗(yàn)采用同樣熒光分光光度法直接測(cè)定細(xì)胞的中性脂含量.具體方法為：2 mL藻液加0.01 mL的尼羅紅染料（質(zhì)量濃度為0.1 g/L丙酮）染色5 min，然后用熒光分光光度計(jì)（MC960），用480 nm光激發(fā)，測(cè)定熒光發(fā)射光譜，以波長為580 nm的熒光強(qiáng)度減去藻細(xì)胞和尼羅紅在該波長處的熒光值，所得相對(duì)熒光強(qiáng)度與細(xì)胞中總脂含量呈線性關(guān)系.

1.2.3 統(tǒng)計(jì)分析

對(duì)3次平行試驗(yàn)結(jié)果，用DPS數(shù)據(jù)數(shù)理系統(tǒng)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析[12].

2 結(jié)果與分析

2.1 氮對(duì)小球藻、微擬球藻生長的影響

試驗(yàn)采用可見分光光度計(jì)觀測(cè)小球藻和微擬球藻的生長，用公式y(tǒng)=2×107x[8]R2=0.993p＜0.05，可以將紫外吸光值（OD500）轉(zhuǎn)換成細(xì)胞數(shù)目，x為OD500值，y為1 mL藻液的細(xì)胞數(shù)目，經(jīng)轉(zhuǎn)換得出微藻的生長狀況見圖1.

由圖1可知，缺氮培養(yǎng)液和正常培養(yǎng)液中的小球藻生長差異顯著，在培養(yǎng)到第7d后，正常氮培養(yǎng)的小球藻達(dá)到了指數(shù)生長期，而缺氮培養(yǎng)的處于生長的延緩期.在培養(yǎng)的前3d，缺氮培養(yǎng)的和正常氮培養(yǎng)的微擬球藻的生長差異不顯著.在培養(yǎng)的第7d后，正常氮培養(yǎng)條件下的微擬球藻顯著高于缺氮處理的（P＜0.05）.

圖1 氮對(duì)小球藻和微擬球藻生長的影響Fig.1 The impact of N on the growth of Chlorella and micro-alga

2.2 鐵對(duì)小球藻、微擬球藻生長的影響

由圖2顯示小球藻富鐵處理和正常鐵處理的生長顯著（P＜0.05）好于缺鐵處理的小球藻，富鐵處理的小球藻在培養(yǎng)的第17d把鐵濃度增加到正常培養(yǎng)基的2倍，也就是10 mg/L.在第19d把鐵濃度增加到2.25倍，也就是12.25 mg/L，結(jié)果與正常鐵比較沒有明顯差異，但都顯著高于缺鐵處理的.微擬球藻在生長初期缺鐵處理生長優(yōu)于其他處理，但在后期不同鐵濃度下生長情況無顯著差異，雖然在第17d時(shí)也把富鐵處理的鐵濃度增加到正常鐵濃度的2倍，也沒有產(chǎn)生顯著的影響.

圖2 鐵對(duì)小球藻和微擬球藻生長的影響Fig.2 The impact of Fe on the growth of Chlorella and micro-alga

2.3 氮對(duì)小球藻和微擬球藻油脂積累的影響

試驗(yàn)通過將處于指數(shù)生長后期的小球藻經(jīng)4000 g離心5 min后，細(xì)胞重懸于缺氮的f/2-Si培養(yǎng)液中培養(yǎng)，用分光光度法測(cè)定生長和油脂積累的動(dòng)態(tài)過程，經(jīng)尼羅紅染色的小球藻，用480 nm光激發(fā)時(shí)的熒光發(fā)射圖譜圖3所示：在培養(yǎng)的前3天，兩種培養(yǎng)液中的小球藻培養(yǎng)的油脂積累差異不顯著，第3天后，缺氮培養(yǎng)液和正常氮培養(yǎng)液的小球藻油脂積累差異極顯著.并且缺氮培養(yǎng)液中的小球藻在第7d出現(xiàn)最高的油脂積累.結(jié)果顯示，缺氮培養(yǎng)基對(duì)小球藻的油脂積累有顯著影響.

圖3 氮對(duì)小球藻和微擬球藻油脂積累的影響Fig.3 The impact of N on the lipid accumulation of Chlorella and micro-alga

與小球藻同步進(jìn)行試驗(yàn)的微擬球藻，其生長和油脂積累的動(dòng)態(tài)過程，其結(jié)果與小球藻一樣，同樣得出缺氮對(duì)微擬球藻的油脂積累有顯著影響.經(jīng)尼羅紅染色后的微擬球藻液的熒光圖譜見圖3，微擬球藻培養(yǎng)自第2d起，正常氮培養(yǎng)下和缺氮培養(yǎng)下的藻細(xì)胞油脂積累差異越顯著，到第7d缺氮培養(yǎng)液的微擬球藻出現(xiàn)最高油脂積累峰值，由此可知，缺氮培養(yǎng)同樣能夠促進(jìn)微擬球藻油脂的積累.

2.4 鐵對(duì)小球藻、微擬球藻油脂積累的影響

經(jīng)尼羅紅染色的小球藻和微擬球藻，熒光發(fā)射光譜見圖4.小球藻在富鐵和正常鐵情況下，脂類積累呈上升趨勢(shì)，富鐵情況下小球藻的脂積累出現(xiàn)兩次高峰，并且富鐵情況下首先出現(xiàn)脂質(zhì)積累.而在缺鐵情況下沒有出現(xiàn)脂積累峰.

如圖5所示，微擬球藻在富鐵和正常鐵情況下也出現(xiàn)脂積累積累情況，富鐵情況下積累高峰稍大于正常鐵情況.在缺鐵情況下則沒有出現(xiàn)脂積累.

圖4 鐵對(duì)小球藻油脂積累的影響Fig.4 The impact of Fe on the lipid accumulation of Chlorella

圖5 鐵對(duì)微擬球藻油脂積累的影響Fig.5 The impact of Fe on the lipid accumulation of micro-alga

3 討論

試驗(yàn)結(jié)果表明氮元素是限制小球藻和微擬球藻生長的因子，但當(dāng)藻類受到氮脅迫時(shí)，微擬球藻和小球藻仍能繼續(xù)生長，是由于光合作用并未中斷，碳元素的同化作用仍繼續(xù)進(jìn)行，導(dǎo)致脂肪酸合成模式的改變，轉(zhuǎn)而合成中性的甘油三酯，并以油滴的形式貯藏在細(xì)胞質(zhì)中.脂肪酸的合成與乙酰輔酶A羧化酶的酶活及酶量有關(guān)，微擬球藻和小球藻在缺氮的培養(yǎng)條件下油脂“急速”積累，是氮源的缺乏誘導(dǎo)了微擬球藻和小球藻細(xì)胞中乙酰輔酶A羧化酶（ACCase）的活性或其細(xì)胞油脂合成時(shí)使乙酰輔酶A羧化酶（ACCase）達(dá)到限速時(shí)所需的酶量.是氮源改變了酶的功能，從而使用于生長的一部分營養(yǎng)轉(zhuǎn)化成為油脂積累的轉(zhuǎn)變，而且它的高含油量于高生長速率是呈逆相關(guān)的[13-15].

Fe3+是藻細(xì)胞內(nèi)葉綠素的重要組成部分，可以促進(jìn)葉綠素合成過程的酶活性，是藻類細(xì)胞內(nèi)某些輔酶和氧化還原載體的組成部分.研究表明，在高濃Fe3+條件下培養(yǎng)Chlorella vulgaris，改變了藻株的代謝途徑，使油脂出現(xiàn)兩次積累高峰，含油量提高了7倍，達(dá)細(xì)胞干重的56.6%，并且高Fe3+濃度對(duì)藻株生長影響不大[2].在小球藻中觀察到的這種油脂大量積累現(xiàn)象，可能是由于已糖庫的代謝途徑由合成淀粉為主轉(zhuǎn)變?yōu)楹铣捎椭?，分叉點(diǎn)在于磷酸已糖的調(diào)用方向[16].本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，不同鐵濃度的培養(yǎng)基對(duì)兩種單細(xì)胞綠藻的生長和油脂積累均有影響，但是富鐵后期對(duì)小球藻和微擬球藻油脂積累影響并不顯著，對(duì)這兩株藻種富鐵處理后期已糖庫的代謝途徑中磷酸已糖的調(diào)用方向是需要進(jìn)一步的研究的關(guān)鍵問題.

研究結(jié)果表明在本實(shí)驗(yàn)中提取的小球藻和微擬球藻在缺氮和不同鐵濃度的培養(yǎng)基中油脂積累均有一定的影響.以期篩選出適于作為生物柴油原料的藻種，為生物質(zhì)能源藻種的篩選提供了基礎(chǔ)，使微藻成為生物柴油的原料更具有研究前景的趨勢(shì).

[1]江紅霞,鄭怡.微藻的藥用、保健價(jià)值及研究開發(fā)現(xiàn)狀(綜述)[J].亞熱帶植物科學(xué),2003,32(1):68-72.

[2]劉志媛,王廣策.鐵促進(jìn)海水小球藻油脂積累的動(dòng)態(tài)過程[J].海洋科學(xué),2008,32(11):56-73.

[3]盧麗娜,孫利芹,田煥玲.32株海洋微藻總脂含量及其脂肪酸組成的研究[J].2009,39(11):68-75.

[4]廖啟斌,李文權(quán),陳清花.營養(yǎng)鹽對(duì)三角褐指藻脂肪酸含量與百分組成的影響[J].2000,19(2):6-9.

[5]楊凱,王涌,史全良.不同質(zhì)量濃度NaN03對(duì)3種微藻生長及總脂肪酸含量和組成的影響[J].植物資源與環(huán)境學(xué)報(bào),2010,19(1):43-49.

[6]Liu Z Y,Wang G C,Zhou B C.Effect of iron on growth and lipid accumulation in Chlorella vulgaris[J].Bioresour Technol,2008,99:4717-4722.

[7]Guillard R R,Ryther J H.Studies of marine planktonic di?atoms.I.Cyclotella nana Hustedt and Detonula conferva?cea(Cleve)Gran[J].Can J Microbiol,1962,8:229-239.

[8]黃旭雄,周洪琪,袁燦東.氮源及濃度對(duì)微綠球藻營養(yǎng)價(jià)值的影響[J].上海水產(chǎn)大學(xué)學(xué)報(bào),2003,12(2):114-118.

[9]吳瑞珊,魏東.Fe3+對(duì)眼點(diǎn)擬球藻的生長和脂肪酸組成的影響[J].海洋科學(xué),2008,7(32):93-96.

[10]Tang Q Y,Feng M G.DFS Data processing system;Ex?perimental design,stantistical analysis,and data mining[M].Bejing:Science Press,2007.

[11]Liu Z Y,Wang G C,Zhou B C.Effect of iron on growth and lipid accumulation in Chlorella vulgaris[J].Bioresour Technoi,2008,99(4):4717-4722.

[12]夏金蘭,李麗,萬民熙,等.兩株微藻的分離鑒定及Fe3+對(duì)其生長和脂質(zhì)積累的影響[J].武漢大學(xué)學(xué)報(bào),2010,56(3):325-330.

[13]齊沛沛,王飛.制備生物柴油用的小球藻的油脂富集培養(yǎng)研究[J].現(xiàn)代化工,2008,2(10):36-41.

[14]童牧,周志剛.新一代生物柴油——微藻[J].農(nóng)業(yè)工程技術(shù)(新能源產(chǎn)業(yè)),2009,5(5):6-27.

[15]赫冬梅,段舜山.代謝調(diào)控在微藻油脂積累中的作用[J].生態(tài)科學(xué),2009,28(1):86-89.

[16]Buchanan B B,Gruissem W,Jones R L.植物生物化學(xué)與分子生物學(xué)[M].北京:科學(xué)出版社,2002:467.

Effect of N and Fe on the cell lipid accumulation of Chlorella and Nannochloropsis

WANG Hui，CHEN Laixi，XIAO Aifeng，LI Hongwu＊
（College of Ocean，Hainan University，Haikou570228，China）

Taking the algae Chlorella HNC1（Chlorella sp.HNC1）and micro-algae HNN1（Nannochloropsis sp.HNN1）separated in Hainan as the research material,the effect of N and Fe3+on the cell lipid accumulation was stu?diced.The results show that:Lack of N can promote the cell lipid accumulation of the chlorella and micro-algae,but the growth was inhibited.Compared with the control,lack of Fe3+in the medium inhibited the growth of Chlorella and oil ac?cumulation;lack of Fe3+inhibited the lipid accumulation of micro-algae,but had no effect on their growth,Rich Fe3+can stimulate the lipid accumulation of chlorella,oil,but has no effect on the micro-algae;There was no significant differ?ence for chlorella and micro algae in the condition of rich or mormal Fe3+.

chlorella sp.；Nannochloropsis sp.；Oil accumulation；growth condition；Fe；N

Q 331

A

1674-4942（2012）01-0086-04

2011-12-10

國家自然科學(xué)基金（40966002）；海南大學(xué)2009科研項(xiàng)目（hd09xm56）；海南省自然科學(xué)基金（409001）；海南大學(xué)211工程創(chuàng)新人才項(xiàng)目計(jì)劃資助

*通訊作者

黃 瀾