曾智發(fā)，柳潤輝，2

(1.福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，福建 福州 350108； 2.第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院，上海 200433)

·藥劑學(xué)·

長春花組織培養(yǎng)研究進(jìn)展

曾智發(fā)1，柳潤輝1，2

(1.福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，福建 福州 350108； 2.第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院，上海 200433)

長春花含有100多種吲哚類生物堿，具有抗腫瘤、降血壓等多種生物活性，有較高的藥用價值，但是含量偏低。長春花組織培養(yǎng)可從提高繁殖系數(shù)、調(diào)控次生代謝產(chǎn)物的累積等來提高長春花生物堿類成分含量。本文就外植體和培養(yǎng)基的選擇、藥用成分累積的影響因素、懸浮細(xì)胞培養(yǎng)應(yīng)用、影響毛狀根因素和基因工程技術(shù)應(yīng)用等方面，綜述了長春花組織培養(yǎng)的主要研究進(jìn)展，為進(jìn)一步開發(fā)利用長春花藥物資源提供參考。

長春花；組織培養(yǎng)；次生代謝產(chǎn)物

長春花Catharanthusroseus(L.) G.Don為夾竹桃科 (Apocynaceae) 長春花屬(Catharanthus) 多年生常綠草本植物,又稱雁來紅、日日新、四時春和三萬花等，原產(chǎn)于非洲東部，現(xiàn)廣泛栽培于熱帶和亞熱帶地區(qū)，我國華東、中南及西南有栽培。長春花全草入藥，具有解毒抗癌、清熱平肝等功效，主治多種腫瘤、高血壓、癰腫瘡毒以及燙傷等[1]。文獻(xiàn)報道，已從長春花中發(fā)現(xiàn)100多種吲哚類生物堿，其中長春堿 (vinblastine) 和長春新堿 (vincristine) 具有抗腫瘤活性；文多靈堿 (vindoleine) 和長春質(zhì)堿 (catharanthine) 是長春堿和長春新堿的前體，具有降血糖作用；阿瑪堿 (ajmalicine) 可治療高血壓；蛇根堿 (serpentine) 具有鎮(zhèn)定作用等。然而長春花中的生物堿含量太低，尤其是長春堿和長春新堿僅為百分之幾至十萬分之幾，不能滿足市場的需求，化學(xué)合成和半合成的結(jié)果也不太理想[2，3]。長春花生物堿類產(chǎn)品的大規(guī)模生產(chǎn)就有可能導(dǎo)致許多不良后果：過度利用野生長春花導(dǎo)致資源枯竭；因生產(chǎn)需要過度擴(kuò)大長春花的種植面積，從而毀壞自然林地、沙灘地[4]。

目前有關(guān)長春花的研究主要集中在長春花的藥理作用、化學(xué)提取、組織培養(yǎng)、長春堿和長春新堿的合成和化學(xué)修飾、生物轉(zhuǎn)化和基因工程等。長春花組織培養(yǎng)技術(shù)主要通過愈傷組織的誘導(dǎo)和細(xì)胞懸浮及毛狀根的大量培養(yǎng)，直接提取長春新堿和長春堿等次生代謝產(chǎn)物作為藥物成分；借助基因工程技術(shù)來闡釋長春花植物體內(nèi)生物堿類成分的合成調(diào)控機(jī)制，篩選出有利于長春花中特定的有效藥用成分積累的途徑。本文對此進(jìn)行綜述，為進(jìn)一步研究、開發(fā)利用長春花藥用成分提供資料。

1 外植體與培養(yǎng)基的選擇

外植體是指進(jìn)行培養(yǎng)的植物材料，包括各種植物器官、組織、細(xì)胞和原質(zhì)體。長春花一般采用芽、葉、莖等部位作為外植體，培養(yǎng)基大多以MS為基本培養(yǎng)基，蔗糖濃度3%，pH 5.8～6.0，另外不同培養(yǎng)階段對培養(yǎng)基的要求也不盡相同。陳泉等[5]以長春花無菌苗的芽為外植體，在MS(基礎(chǔ)培養(yǎng)基)培養(yǎng)基上組合不同激素，得到生長旺盛、葉色濃綠的壯苗，芽增殖系數(shù)多達(dá)4.83；進(jìn)一步生根培養(yǎng)，得到的發(fā)根早且根系狀態(tài)好，長勢旺，無愈傷組織，也沒有新芽誘出，生根率最高，平均根數(shù)多。唐忠海等[6]以根、莖、葉為外植體，葉片對愈傷組織的誘導(dǎo)率高達(dá)88%，為最高，根次之，莖的誘導(dǎo)率最低。嚴(yán)春艷等[7]以長春花的幼嫩葉片為外植體，誘導(dǎo)的愈傷組織呈黃褐色疏松狀，且誘導(dǎo)率高達(dá)90%。

2 影響長春花中主要藥用成分積累的因素

植物組織培養(yǎng)不僅可以促進(jìn)植物的生長發(fā)育，還能夠增加植株內(nèi)次生代謝產(chǎn)物的積累。長春花細(xì)胞組織培養(yǎng)及其細(xì)胞生長和生物堿的合成,受內(nèi)部機(jī)制和外部環(huán)境共同調(diào)控[8]。為了提高長春花中生物堿類成分的含量，長春花組織培養(yǎng)大都進(jìn)行了不同的物理、化學(xué)因素的調(diào)控。

2.1化學(xué)因素

2.1.1植物調(diào)節(jié)劑 不同種類、濃度和比例的植物生長調(diào)節(jié)劑，可以調(diào)節(jié)培養(yǎng)物的生長發(fā)育進(jìn)程、分化方向和器官發(fā)生。長春花組織培養(yǎng)中，常用生長素有IAA(吲哚乙酸)、NAA(萘乙酸)、2,4-D(二氯苯氧乙酸)，常用細(xì)胞分裂素有6-BA(芐基腺嘌呤)、KT(激動素)，生長素和細(xì)胞分裂素可單獨(dú)使用，也可進(jìn)行不同濃度的組合，根據(jù)培養(yǎng)階段和外植體情況而定。2，4-D有利于長春花的正常愈傷組織生長，但卻抑制突變愈傷組織的生長，對于二者的吲哚總堿的積累有抑制作用，而采用NAA或IAA替代2,4-D后，吲哚總堿含量有所增加，兩種生長素的組合比單一的生長素更利于吲哚總堿積累，尤其是NAA和IAA共同作用最有利于吲哚總堿積累[9，10]。長春花細(xì)胞培養(yǎng)早期添加外源性細(xì)胞分裂素或者后期添加乙烯(通過乙烯利降解)均可以極大地提高長春花細(xì)胞中阿瑪堿的含量，兩者聯(lián)合使用對阿瑪堿含量的影響具有相加效應(yīng)[11]。Garnier等[12]進(jìn)一步對比外源性細(xì)胞分裂素和內(nèi)源性細(xì)胞分裂素對愈傷組織中生物堿含量的變化，最后發(fā)現(xiàn)外源性細(xì)胞分裂素可以提高正常愈傷組織中阿瑪堿和蛇根堿的含量，內(nèi)源性細(xì)胞分裂素則不能產(chǎn)生類似的效果。

2.1.2誘導(dǎo)及誘變作用 誘導(dǎo)子(elicitor)是指能夠引起目標(biāo)生物體發(fā)生生理變化的各種生物與非生物因子。廣義的誘導(dǎo)子包括各種生物與非生物因子。狹義的誘導(dǎo)子專指生物來源的誘導(dǎo)子和人工合成的生物誘導(dǎo)子類似物。外源施加的誘導(dǎo)子能夠通過信號分子轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑， 促進(jìn)長春花生物堿合成途徑中相關(guān)基因的表達(dá)，以誘導(dǎo)特定的次生代謝產(chǎn)物形成和積累[13]。

非生物誘導(dǎo)子常用輻射誘變、化學(xué)誘變、金屬離子等篩選出有利于長春花生物堿類成分積累的變異體系。長春花種子經(jīng)60Co γ射線不同劑量處理，得到的高桿變異植株中文多靈堿和長春質(zhì)堿含量比未輻射照射組分別多出24%和26%[14]。長春花愈傷組織通過不同濃度的甲基磺酸乙酯(EMS)處理，可獲得生長快且吲哚堿含量高的長春花突變細(xì)胞系[15]。李鐵軍等[16]以秋水仙素為誘導(dǎo)劑，篩選得到長春花同源四倍體，獲得的四倍體的莖、葉、花、果變大，單株干重也高于二倍體。茉莉酸甲酯誘導(dǎo)培養(yǎng)的長春花懸浮細(xì)胞內(nèi)外的Ca2+濃度可以明顯影響阿瑪堿的含量[17]。

生物誘導(dǎo)子來源包括真菌、細(xì)菌、病毒等。張向飛等[18]發(fā)現(xiàn)來源于鐮刀菌Fusarium solani和黑曲霉Aspergillum niger的真菌誘導(dǎo)子對吲哚總堿及其中阿瑪堿和長春質(zhì)堿的積累均有較明顯的正向調(diào)節(jié)作用。石岳香等[19]從長春花莖桿韌皮部分離出內(nèi)生真菌，研究其對長春花中長春花生物堿合成的影響，發(fā)現(xiàn)內(nèi)生真菌本身不能直接合成長春花生物堿，而可能對生物堿的合成起促進(jìn)作用。茉莉酸甲酯作為一種植物脅迫信號，是誘導(dǎo)STR和TDC表達(dá)中的最重要的第二信使[20]。茉莉酸甲酯的添加劑量和添加時間可以明顯影響長春花懸浮細(xì)胞中阿瑪堿含量，最高可使含量增加300%[21]。茉莉酸甲酯還可以大大增強(qiáng)長春花毛狀根中G10h、 Tdc、Str和 Sgd的表達(dá)量，從而提高異胡豆苷、阿瑪堿和水甘草堿的含量[22]。

2.1.3前體物質(zhì)的添加 前體是目的產(chǎn)物合成途徑中的中間代謝物，通過前體飼喂可以定向地提高某些次生代謝產(chǎn)物的含量，并大大縮短培養(yǎng)周期。添加香葉醇、10-羥基香葉醇和馬錢子苷其中任何一種，可以顯著增加它波寧堿的積累，添加色胺和色氨酸則沒有影響[23]。但并非所有前體飼喂都可增加次生代謝產(chǎn)物含量，在茉莉酸甲酯誘導(dǎo)培養(yǎng)的長春花毛狀根中添加馬錢子苷、色胺及兩者組合物等前體物質(zhì)，異胡豆苷、阿瑪堿和水甘草堿等生物堿的含量無明顯變化[24]。這可能與長春花中的次生代謝產(chǎn)物具體步驟及其生物合成機(jī)制不明確有關(guān)，而且生物堿合成途徑的前體活性受到諸多因素影響。Lee-Parsons等[25]測定茉莉酸甲酯如何改變馬錢子苷、色胺、馬錢子苷和色胺的組合物，以及香葉醇等生物堿合成途徑的前體活性，結(jié)果顯示：在誘導(dǎo)和非誘導(dǎo)的培養(yǎng)過程中，添加過量的馬錢子苷會使色胺受限；在誘導(dǎo)培養(yǎng)中，茉莉酸甲酯可以增加香葉醇的活性，而非誘導(dǎo)培養(yǎng)中，添加香葉醇可以增加阿瑪堿的含量。

2.1.4pH值 pH值是酸堿度環(huán)境，它主要影響植物酶的生化反應(yīng)等生理過程，同時也影響一些培養(yǎng)基中離子的溶解度。培養(yǎng)基初始pH在4.5～7.5范圍內(nèi)變動時，對愈傷組織生長及吲哚總堿的積累影響不大[9]。

2.2物理因素

2.2.1光照條件 植物利用光照進(jìn)行光合作用，為植物的生長和次生代謝產(chǎn)物的積累提供能量。所以不同的光照條件對長春花的生長發(fā)育及其總生物堿的積累有重要影響。弱光條件明顯抑制了長春花有性生殖，抑制了長春堿含量的增加，促進(jìn)了長春花葉片中文多靈堿和長春質(zhì)堿兩種生物堿的積累[26]。周憶堂探討不同光照條件(透光率分別為100%、42.5%、12.5%)對長春花個體生長及生物堿合成累積等生理過程的影響，發(fā)現(xiàn)42．5%光強(qiáng)最有利于長春花植株生長以及生物堿積累[27]。長春花愈傷組織在黑暗和光照(12～14 h/d)下的生長曲線均呈“S”型，總堿產(chǎn)量變化曲線類似于生長曲線，但光照條件下的細(xì)胞生長速度較快[28]。

2.2.2其它因素 長春花的生物堿類成分含量還受到植株的組織部位、愈傷組織繼代周期、繼代天數(shù)等因素影響。Aslam等[22]采用HPLC定量分析長春花愈傷組織等各種離體組織中長春新堿，結(jié)果顯示長春新堿的含量取決于特定的組織和生長周期：長春新堿含量在20～25周有所提高，而且在葉片誘導(dǎo)的愈傷組織和萌發(fā)胚較高。

3 長春花懸浮細(xì)胞培養(yǎng)的應(yīng)用

利用細(xì)胞培養(yǎng)法獲得長春花中生物堿類成分的一般步驟為：誘導(dǎo)愈傷組織→愈傷組織繼代培養(yǎng)→細(xì)胞懸浮培養(yǎng)→擴(kuò)大細(xì)胞培養(yǎng)，因此長春花細(xì)胞懸浮培養(yǎng)是長春花細(xì)胞工業(yè)化、產(chǎn)業(yè)化的必經(jīng)步驟。與固體培養(yǎng)基相比，細(xì)胞懸浮培養(yǎng)具有繁殖速度快、能大規(guī)模培養(yǎng)和提供大量均勻一致的植物細(xì)胞培養(yǎng)物的特點(diǎn)，懸浮細(xì)胞培養(yǎng)受到許多外界條件的影響，如激素、光照、誘導(dǎo)子、培養(yǎng)基、pH值、溫度和營養(yǎng)等。

2,4-D、NAA和6-BA 3種激素組合時，更有利于懸浮細(xì)胞的生長，且比單因子更有效果；1/2 MS和B5培養(yǎng)基有利于細(xì)胞的生長；蔗糖濃度為30 g/L時，細(xì)胞生長最快，低于或高于此濃度，其細(xì)胞生長速度都會下降； pH 值在5.0～5.4時最適于長春花懸浮細(xì)胞的生長[29]。長春花懸浮細(xì)胞在黑暗和光照(12～14 h/d)下培養(yǎng)的生長曲線均呈“S”型，但光照有利于細(xì)胞生長，比黑暗條件下提前了3 d，達(dá)到了最大生長量[30]。添加不同濃度的外源脫落酸(ABA)、乙烯利和乙酰水楊酸(ASA)可明顯提高長春花懸浮細(xì)胞的吲哚總堿及其阿瑪堿和長春質(zhì)堿含量[31]。內(nèi)生真菌和內(nèi)生真菌誘導(dǎo)子不僅明顯增加長春花懸浮細(xì)胞中生物堿合成的關(guān)鍵性酶PAL(苯丙氨酸解氨酶)、TDC(色氨酸脫羧酶)活性，還明顯提高了生物堿含量[32]。

4 影響長春花毛狀根的因素

與愈傷組織和細(xì)胞懸浮培養(yǎng)相比，由發(fā)根農(nóng)桿菌及其Ri質(zhì)粒轉(zhuǎn)化產(chǎn)生的毛狀根具有無激素快速自主生長、遺傳穩(wěn)定、分化程度高、擁有親本植株的特征和次生代謝途徑等特點(diǎn)；更重要的是，毛狀根的次生代謝物的含量不僅更高，而且還能產(chǎn)生某些植物愈傷組織和懸浮細(xì)胞所不能合成的有效成分[33]。毛狀根生長及其次生代謝產(chǎn)物的形成受培養(yǎng)條件、外源激素、誘導(dǎo)子等各種理化因素的影響。劉紅蕾等[34]認(rèn)為長春花發(fā)根的生長與生物堿積累是兩個相對獨(dú)立的過程：發(fā)根本身具有合成及調(diào)節(jié)激素水平的因子，其生長基本不受外界色氨酸含量及激素水平的影響，但是適量添加色氨酸卻有利于生物堿的積累；蔗糖的不同濃度、培養(yǎng)溫度、搖床轉(zhuǎn)速對生長影響較大，而對單位質(zhì)量發(fā)根中生物堿的積累幾乎沒有影響；不同碳源對發(fā)根生長及產(chǎn)堿有較大影響。孫敏等[35，36]用A4和R10002種發(fā)根農(nóng)桿菌菌株分別感染長春花的愈傷組織、真葉、葉柄及根，誘導(dǎo)出毛狀根，并進(jìn)行發(fā)根生長和產(chǎn)堿測定。其結(jié)果為：A4的轉(zhuǎn)化頻率高于R1000，乙酰丁香酮對轉(zhuǎn)化頻率有促進(jìn)作用；毛狀根的最佳生長條件為1/2MS培養(yǎng)基、蔗糖為碳源、水解乳蛋白為氮源；毛狀根中的總生物堿含量高于長春花的原植株和愈傷組織，并且檢測到長春堿和長春新堿。

5 基因工程技術(shù)在長春花中的應(yīng)用

長春花生物堿代謝途徑非常復(fù)雜，受到許多關(guān)鍵酶的調(diào)控，由于不表達(dá)一些合成途徑的關(guān)鍵酶基因，使得長春花中部分生物堿不合成或者含量極低?；蚬こ碳夹g(shù)可以使某些關(guān)鍵酶基因獲得表達(dá)，從而提高生物堿含量，有助于闡釋長春花生物堿生物合成機(jī)制和篩選出高產(chǎn)特定生物堿的長春花體系。

岳慶喜等[37]發(fā)現(xiàn)長春花細(xì)胞C20hi中合成阿瑪堿的7個關(guān)鍵酶基因asa、tdc、hmgr、g10h、scs、sss、sgd的轉(zhuǎn)錄表達(dá)量明顯高于母株細(xì)胞C20D，尤其是g10h、scs、sss基因，C20hi中阿瑪堿的過量合成可能與2，4-D抑制了阿瑪堿生物合成關(guān)鍵酶的表達(dá)水平有關(guān)。g10h基因的表達(dá)與長春花生物堿(文多靈和長春質(zhì)堿)含量呈顯著的正相關(guān)，文多靈的含量和str基因的表達(dá)水平相關(guān)性好，g10h和str基因可以作為長春花中文多靈和長春質(zhì)堿含量的參考基因標(biāo)記[38]。韓梅等[39]分離和擴(kuò)增得到長春花萜類吲哚生物堿合成途徑中編碼關(guān)鍵酶(DXR、SLS、 G10H和STR)的cDNA基因片段, 利用Gateway技術(shù)對這些目的基因進(jìn)行質(zhì)粒重組，并成功表達(dá)。這一結(jié)果使得短期內(nèi)大規(guī)模的分離和克隆長春花中參與長春堿和長春新堿生物合成途徑中的多個相關(guān)酶和基因成為可能。Ag112轉(zhuǎn)錄因子具有高選擇性，它可以影響長春花懸浮細(xì)胞的分化方向，提高長春花懸浮細(xì)胞合成生物堿的關(guān)鍵酶基因編碼表達(dá)，而且經(jīng)過基因改造后能夠表達(dá)Ag112的細(xì)胞系可以產(chǎn)生高含量的阿瑪堿[40]。長春花中的單萜類生物堿的生物合成途徑在細(xì)胞和細(xì)胞內(nèi)的各種膜發(fā)生，ATP-結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白與細(xì)胞中轉(zhuǎn)運(yùn)各種單萜類生物堿有關(guān)，因此，提高長春花細(xì)胞中ATP-結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因CjMDR1的表達(dá)能夠顯著增加細(xì)胞中阿瑪堿和四氫鴨腳木堿的含量[41]。

6 結(jié)語與展望

長春花的組織培養(yǎng)技術(shù)已經(jīng)取得了很大的進(jìn)展，長春花的初代愈傷組織的誘導(dǎo)相對容易，用莖、葉和芽誘導(dǎo)愈傷組織的誘導(dǎo)率相對較高，長春花懸浮培養(yǎng)在搖瓶中已經(jīng)獲得了成功，甚至采用70L環(huán)形通氣攪拌生物反應(yīng)器對長春花細(xì)胞的大規(guī)模懸浮培養(yǎng)也取得成功[42]，長春花毛狀根的誘導(dǎo)培養(yǎng)也已獲得成功，但仍未能進(jìn)行大規(guī)模培養(yǎng)。目前可以用長春花愈傷組織、懸浮細(xì)胞和毛狀根中生產(chǎn)阿瑪堿、蛇根堿和長春質(zhì)堿，但不能檢測到長春堿和長春新堿，這可能與這些培養(yǎng)體系中不能或者極少合成雙吲哚生物堿的重要前體文多靈有關(guān)[13]。

添加阿司匹林、布洛芬和萘普生等環(huán)加氧酶抑制劑，降低長春新堿和長春堿的旁路合成，雖然未能提高長春花懸浮細(xì)胞中長春新堿和長春堿的含量，卻顯著提高長春新堿和長春堿的前體——長春質(zhì)堿的含量[43]，這說明不同的理化因素可以改變長春花生物堿合成途徑中某些關(guān)鍵酶的活性或者關(guān)鍵酶基因的表達(dá)，進(jìn)而特異性地影響長春花中某些生物堿的積累。長春花細(xì)胞中文多靈的合成在轉(zhuǎn)錄水平上受到抑制，即檢測不到關(guān)鍵酶基因D4H和DAT基因的表達(dá)，但這兩種基因并未丟失[44]。因此，利用不同的理化因素調(diào)控，或者通過基因工程等技術(shù)誘導(dǎo)長春花細(xì)胞和毛狀根中D4H和DAT等關(guān)鍵酶基因的表達(dá)，以促進(jìn)文多靈的生物合成，選育出能夠合成長春新堿和長春堿的細(xì)胞和毛狀根培養(yǎng)體系，為工業(yè)化、產(chǎn)業(yè)化開發(fā)長春花藥用成分開辟出新的道路。

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ProgressontissuecultureofCatharanthusroseus

ZENG Zhi-fa1，LIU Run-hui1，2

(1. School of Pharmacy,Fujian University of Traditional Chinese Medicine，F(xiàn)uzhou 350108,China；2. School of Pharmacy,Second Military Medical University，Shanghai 200433,China)

Catharanthusroseus(L.) G.Don contained more than 100 known indole alkaloids, some of which had anti-cancer, lowering blood pressure and other biological activity.Catharanthusroseushad a high medicinal value, but the content of alkaloids was very low. In order to improve the content of alkaloid, the technology of tissue culture had been applied inCatharanthusroseus, such as improving the propagation coefficient and controlling the accumulation of secondary metabolites. To provide reference in further development and utillzation ofCatharanthusroseusdrug resources, the main research progress of tissue culture ofCatharanthusroseusincluding the impact factors of medicinal components accumulation, suspension cell culture applications, the impact factors of hairy roots and application of genetic engineering technology were reviewed in this paper.

Catharanthusroseus(L.) G.Don; tissue culture; secondary metabolites

曾智發(fā)(1985-)，男，碩士研究生,Tel：13916289413， E-mail:zzhf123@yahoo.com.cn.

柳潤輝.Tel：13611879691，E-mail:lyliurh@126.com.

R931.2

A

1006-0111(2012)04-0258-05

10.3969/j.issn.1006-0111.2012.04.004

2011-11-02

2011-12-28