唐志斌，廖 瑛

（南華大學(xué)第一附屬醫(yī)院骨外科，湖南 衡陽(yáng) 421001）

microRNA是近年來發(fā)現(xiàn)于真核細(xì)胞中的一類內(nèi)源性非編碼小分子RNA，它在調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄和蛋白翻譯中發(fā)揮重要的作用，是近年來生命科學(xué)的研究熱點(diǎn)，人類miRNA通過調(diào)控其靶基因的表達(dá)及相關(guān)信號(hào)通路，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)歸過程中發(fā)揮重要作用［1］。研究表明，miR-124在宮頸癌和肝癌組織中表達(dá)下調(diào)，miR-124可通過靶向ITGB1抑制口腔鱗狀細(xì)胞癌的生長(zhǎng)，也可通過靶向CDK6抑制髓母細(xì)胞瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)與浸潤(rùn)［2-5］。本文采用MTT檢測(cè)miR-124對(duì)人成骨肉瘤MG-63細(xì)胞增殖的影響，為進(jìn)一步闡明成骨肉瘤發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞系

MG-63細(xì)胞為人成骨肉瘤細(xì)胞系，購(gòu)自北京協(xié)和細(xì)胞生物所。MG-63細(xì)胞培養(yǎng)于含15%小牛血清的MEM培養(yǎng)基（Gibco公司）。

1.1.2 試劑

MTT為Sigma產(chǎn)品；脂質(zhì)體2000購(gòu)自Invitrogen公司；miR-124模擬物與抑制劑購(gòu)自上海吉瑪生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

MG-63細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)，選擇對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

1×104細(xì)胞于96孔板中，完全培養(yǎng)基中細(xì)胞生長(zhǎng)至30%匯合期。加入2.5μL的脂質(zhì)體于100μL無血清培養(yǎng)基中混勻靜置15min，稀釋12.5pmol的miR-124模擬物或抑制劑于50μL無血清培養(yǎng)基中，混合上述脂質(zhì)體與DNA稀釋液，室溫放置30min；分別用PBS與無血清培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞；將上述混合物加入96孔板中，然后再加100μL無血清培養(yǎng)基，CO2培養(yǎng)箱中，37°C培養(yǎng)6h；棄上清，加入完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)過夜。

1.2.3 MTT法測(cè)定

設(shè)立空白對(duì)照組、脂質(zhì)體組、miR-124模擬物組以及miR-124抑制劑組。每組設(shè)立4個(gè)重復(fù)孔，分別在轉(zhuǎn)染24h、48h和72h后，每孔加入 MTT溶液（5mg／ml）20μL，繼續(xù)孵育4h，終止培養(yǎng)，棄去培養(yǎng)液，每孔加入150μL二甲亞砜，震蕩10min，選擇570nm波長(zhǎng)，在酶標(biāo)儀上測(cè)定各孔的吸光度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 miR-124模擬物對(duì)人成骨肉瘤MG-63細(xì)胞增殖活性的影響

人成骨肉瘤MG-63細(xì)胞經(jīng)miR-124模擬物處理后，細(xì)胞生長(zhǎng)明顯比未處理細(xì)胞的生長(zhǎng)減緩；處理24h、48h、72h后其吸光值 A值分別為（0.149±0.006）、（0.163±0.007）、（0.212±0.009），分別與對(duì)照組（0.261±0.017）、（0.379±0.021）、（0.414±0.031）相比，均顯著下調(diào)，具有顯著抑制作用，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），提示miR-124模擬物可抑制人成骨肉瘤MG-63細(xì)胞增殖活性。

2.2 miR-124抑制劑對(duì)人成骨肉瘤MG-63細(xì)胞增殖活性的影響

人成骨肉瘤MG-63細(xì)胞經(jīng)miR-124抑制劑處理后，細(xì)胞生長(zhǎng)明顯比未處理細(xì)胞的生長(zhǎng)迅速；處理24h、48h、72h后其吸光值 A值分別為（0.313±0.016）、（0.542±0.033）、（0.713±0.041），分別與對(duì)照組（0.261±0.017）、（0.379±0.021）、（0.414±0.031）相比，均顯著上調(diào)，具有顯著促進(jìn)作用，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），提示miR-124抑制劑可促進(jìn)人成骨肉瘤MG-63細(xì)胞增殖活性。

3 討論

骨肉瘤又稱成骨肉瘤，是惡性骨腫瘤中最常見惡性程度最高的一種，又分為成骨性骨肉瘤及溶骨性骨肉瘤兩類。發(fā)病年齡多在15～25歲。70%以上的患者發(fā)生在股骨遠(yuǎn)端和脛骨近端。惡性腫瘤難以治愈的主要原因就是不容易早期診斷，一旦確診，大多數(shù)已經(jīng)到中晚期，已形成較廣泛的浸潤(rùn)或轉(zhuǎn)移，臨床治療效果差。成骨肉瘤肺轉(zhuǎn)移是目前導(dǎo)致患者治療失敗和死亡的最主要的原因。

miRNA是新近證明的一類長(zhǎng)約19～25nt的內(nèi)源性非編碼的小分子RNA，在多個(gè)物種中廣泛存在，包括動(dòng)物、植物和病毒。目前，被證實(shí)的小RNA就有500多種，而計(jì)算機(jī)預(yù)測(cè)可能會(huì)超過1000個(gè)，且約1／3的人類基因被小RNA調(diào)控。隨著更多的miRNA被鑒定和深入研究，越來越多的證據(jù)表明，miRNA在細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、發(fā)育和凋亡過程中扮演著重要角色，并與多種腫瘤的發(fā)生有關(guān)。目前，有研究利用針對(duì)目的miRNA進(jìn)行模擬物過表達(dá)或者抑制劑干擾miRNA來研究各種miRNA在細(xì)胞中的生物學(xué)功能［6］。miR-124在多種腫瘤組織和細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)［2-5］，本研究顯示miR-124的模擬物及抑制劑分別可抑制和促進(jìn)人成骨肉瘤MG-63細(xì)胞生長(zhǎng)增殖活性，提示miR-124可能作為抑瘤基因miRNA參與成骨肉瘤的發(fā)生發(fā)展。

miRNA可以作為新的分子標(biāo)志物用于惡性腫瘤的早期診斷和預(yù)后預(yù)測(cè)，將展示出廣闊的臨床應(yīng)用前景。針對(duì)miR-124建立行之有效的檢測(cè)手段以及靶向治療策略，為進(jìn)一步闡明成骨肉瘤發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制，將為成骨肉瘤早期診斷、治療方案選擇、療效評(píng)價(jià)以及預(yù)后判斷提供重要的理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。綜上所述，miR-124有調(diào)控骨肉瘤細(xì)胞的增殖能力，miRNA是一種天然的反義作用因子，利用miRNA模擬物或抑制劑可能成為基因治療骨肉瘤的一個(gè)新的研究方向。但miR-124不是骨肉瘤中唯一異常表達(dá)的miRNA，因此應(yīng)該找出更多異常表達(dá)的miRNA分子，發(fā)現(xiàn)它們之間的聯(lián)系，為更好理解骨肉瘤的發(fā)生機(jī)制及骨肉瘤的基因治療提供更好的理論支持。

［1］ZHANG L，DENG T，LI X，et al.microRNA-141is involved in a nasopharyngeal carcinoma-related genes network［J］.Carcinogenesis.2010，31（4）：559-66.

［2］FURUTA M，KOZAKI KI，TANAKA S，et al.miR-124and miR-203are epigenetically silenced tumor-suppressive microRNAs in hepatocellular carcinoma.Carcinogenesis［J］.2010，31（5）：766-76.

［3］LI KK，PANG JC，CHING AK，et al.miR-124is frequently down-regulated in medulloblastoma and is a negative regulator of SLC16A1［J］.Hum Pathol，2009，40（9）：1234-43.

［4］PIERSON J，HOSTAGER B，F(xiàn)AN R，et al.Regulation of cyclin dependent kinase 6by microRNA 124in medulloblastoma［J］.J Neurooncol，2008，90（1）：1-7.

［5］HUNT S，JONES AV，HINSLEY EE，et al.MicroRNA-124 suppresses oral squamous cell carcinoma motility by targeting ITGB1［J］.FEBS Lett，2011，585（1）：187-92.

［6］吳子晏，劉小云，楊述華，等.miR-21對(duì)骨肉瘤細(xì)胞增殖的影響［J］.中國(guó)癌癥雜志，2010，20（8）：561-564.