沈國平，朱德銳＊＊，劉 建，韓 睿，龍啟福

(1:青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院，西寧810016)

(2:華中師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，武漢430079)

(3:青海大學(xué)農(nóng)林科學(xué)院，西寧810016)

青海湖嗜鹽微生物篩選分離與生長特性*

沈國平1，朱德銳1＊＊，劉 建2，韓 睿3，龍啟福1

(1:青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院，西寧810016)

(2:華中師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，武漢430079)

(3:青海大學(xué)農(nóng)林科學(xué)院，西寧810016)

為全面獲得青海湖嗜鹽菌種質(zhì)資源，構(gòu)建種群系統(tǒng)發(fā)育樹和確定種群進(jìn)化定位.采用高鹽選擇性培養(yǎng)基篩選，分離從20份青海湖水樣中獲得35株青海湖嗜鹽微生物.耐鹽梯度實(shí)驗(yàn)表明:水體中以中度嗜鹽菌為主，約占62.85%，輕度嗜鹽菌約占22.85%，非嗜鹽菌與耐鹽菌約占14.28%.青海湖中度嗜鹽微生物能在10～45℃，pH 5.5～11.0的范圍內(nèi)生長，與地區(qū)鹽堿化環(huán)境相關(guān)，具有嗜鹽兼嗜堿微生物的特性.

青海湖;嗜鹽菌;分離篩選;生長特性

青海湖(36°32'～38°15'N，99°36'～100°47'E)位于青藏高原東北隅［1］，是中國最大的內(nèi)陸湖泊，也是中國最大的咸水湖，地處西北干旱/半干旱環(huán)境敏感帶［2］，具有重要的生態(tài)環(huán)境研究價(jià)值.青海湖是青藏高原生物多樣性最豐富的寶庫，也是極端微生物基因資源的寶庫，其海拔3195 m，水溫低，鹽度略低于海水，水體中富集嗜鹽微生物.嗜鹽微生物作為一類新型的、極具應(yīng)用前景的海洋微生物資源，近年倍受關(guān)注，諸如嗜鹽機(jī)理、細(xì)菌視紫紅質(zhì)和嗜鹽菌素等基礎(chǔ)研究，環(huán)境生物治理、生物電子和醫(yī)藥工業(yè)等應(yīng)用研究方面［3］.

目前，根據(jù)海洋原核生物名錄統(tǒng)計(jì)共846屬2292種，其中海洋古菌66屬189種，海洋細(xì)菌780屬2103種［4］.隨著海洋、湖泊微生物的多樣性、生態(tài)、生理、生化、遺傳和進(jìn)化研究，必將豐富基因組學(xué)及后基因組學(xué)，亦將推動(dòng)海洋、湖泊微生物資源的開發(fā)與應(yīng)用研究.嗜鹽微生物作為重要的海洋和咸水湖泊微生物類群之一，主要包括嗜鹽古菌、嗜鹽細(xì)菌和嗜鹽真核微生物三類，其中嗜鹽古菌科(Halobacteria)現(xiàn)有18屬［5］.近年來，我國學(xué)者針對(duì)西藏、新疆、內(nèi)蒙古等西部地區(qū)鹽湖［6］、南極深海［7］、青島鹽田［8］、舟山地區(qū)［9］的報(bào)道相對(duì)較多，而對(duì)青海湖嗜鹽微生物的研究相對(duì)較少.鑒于青海湖生態(tài)環(huán)境條件特殊，屬內(nèi)陸鹽湖，缺氧低壓，晝夜溫差大，其微生物具有典型的生理生化適應(yīng)性.本研究旨在分離篩選青海湖優(yōu)勢(shì)嗜鹽菌以獲得全面的種質(zhì)資源，以此了解青海湖嗜鹽微生物的多樣性，為后續(xù)構(gòu)建種群系統(tǒng)發(fā)育樹，確定種群進(jìn)化定位和嗜鹽微生物資源的開發(fā)利用提供基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 樣品來源

2009年7月，沿環(huán)湖路線采集青海湖漁場(chǎng)、湖東洱海旅游景區(qū)、青海湖賓館、青海湖二郎劍景區(qū)、黑馬河、塘曲、冬格日隴哇、鳥島、海心山等地區(qū)水樣20份，樣品采集后置于4℃冰箱暗處保存.

1.2 主要試劑

Yeast extract(英國 OXOID 公司)、細(xì)菌蛋白胨、檸檬酸鈉、葡萄糖、NaCl、KCl、MgSO4·7H2O、CaCl2·2H2O和瓊脂粉等(分析純，天津恒興公司).

1.3 主要儀器

電熱恒溫干燥箱(PH050，上海實(shí)驗(yàn)儀器廠)、電子天平(PL203METTLER TOLEDO公司)、恒溫?fù)u床(ZD-85，上海精達(dá)公司)、恒溫培養(yǎng)箱(ZHWY-100B，上海智城公司)、無菌操作臺(tái)(上海博訊公司)、754紫外分光光度計(jì)(上海光譜儀器).

1.4 菌株分離和形態(tài)特征觀察

菌種分離和富集培養(yǎng)采用RM培養(yǎng)基［10］:1 L培養(yǎng)基含NaCl 50.0 g，無水 MgSO49.7 g，檸檬酸鈉3.0 g，KCl 2.0 g，無水 CaCl20.2 g，細(xì)菌蛋白胨 10.0 g，酵母抽提物 2.0 g，pH 7.5.固體培養(yǎng)基加瓊脂 15 g，121℃滅菌15 min，保存?zhèn)溆?

將采集的水樣直接加到液體培養(yǎng)基中(1∶100)，37℃、120 r/min，恒溫振蕩培養(yǎng)3 d.取培養(yǎng)基10 μl，稀釋(×1000)后涂布平板，37℃恒溫培養(yǎng)，依據(jù)菌落形態(tài)(形狀、大小、顏色及表面特征)，挑取單菌落反復(fù)劃線純化3～4次，將最后一次挑取的單菌落接入液體培養(yǎng)基，振蕩培養(yǎng)12 h，10%甘油，－20℃凍存?zhèn)溆?在RM固體培養(yǎng)基上觀察菌落形態(tài)，采用革蘭氏染色法在光鏡下觀察菌體形態(tài).

1.5 生長特性研究

耐鹽度試驗(yàn)［11］:過夜培養(yǎng)菌株，以1%接種量接種于不同NaCl濃度梯度的RM液體培養(yǎng)基中(%，W/V:0、0.25、0.50、0.75、1.00、1.25、1.50、1.75、2.00 ～17.50)，三組平行，37℃、150 r/min 振蕩培養(yǎng) 12 h，用 722分光光度計(jì)測(cè)定培養(yǎng)液光密度值(OD600)，取其平均值.

最適生長溫度試驗(yàn)［11］:將菌株接種于含 5%NaCl的 RM 液體培養(yǎng)基中，分別置于 10、15、20、25、30、35、37、40、45℃溫度梯度中，三組平行，150 r/min振蕩培養(yǎng)12 h，測(cè)定培養(yǎng)液的光密度值(OD600)，取其平均值.

pH值對(duì)生長影響的測(cè)定［11］:將菌株接種于pH 3～12的含5%NaCl濃度的RM液體培養(yǎng)基中，三組平行，37℃、150 r/min，振蕩培養(yǎng)12 h，測(cè)定培養(yǎng)液的光密度值(OD600)，取其平均值.

Mg2+對(duì)生長影響的測(cè)定:將菌株接種于0～2.0 mol/L的MgSO4的RM液體培養(yǎng)基中，三組平行，37℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)12 h，測(cè)定培養(yǎng)液的光密度值(OD600)，取其平均值.1.6碳氮源利用實(shí)驗(yàn)

碳氮源利用實(shí)驗(yàn)，參照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》［12］和《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》(第8版)［13］進(jìn)行.

2 結(jié)果與分析

2.1 形態(tài)及培養(yǎng)特征

通過對(duì)20份青海湖水樣的富集篩選、平板涂布和三次平板劃線分離純化，依據(jù)平板菌落不同生長形態(tài)特征，初步篩選出青海湖嗜鹽微生物種質(zhì)資源35株，其中細(xì)菌34株，真菌1株，具體結(jié)果見表1.在菌落形態(tài)特征上，圓形或橢圓形占88.57%，顏色以白色或乳白色居多，其中因天然色素存在于一些菌體中，菌落呈紅色、橙紅色、黃色或淡藍(lán)色，約占40%.在顯微結(jié)構(gòu)形態(tài)上，長桿或短桿狀約占80%，球形或弧形約占14.28%，絲狀約占5.7%，革蘭氏染色陰性菌約占74.28%.

表1 青海湖水體嗜鹽微生物菌落形態(tài)特征Tab.1 The colony morphology of halophile microorganisms in Lake Qinghai

2.2 嗜鹽特性與分類統(tǒng)計(jì)

通過耐鹽梯度試驗(yàn)，確定35株嗜鹽微生物種質(zhì)資源的生長鹽度范圍和最適生長鹽度范圍(表2)，參照嗜鹽微生物分類標(biāo)準(zhǔn)［14］進(jìn)行初步分類，結(jié)果表明水體中嗜鹽微生物以中度嗜鹽菌為主，約占62.85%，輕度嗜鹽菌約占22.85%，非嗜鹽菌與耐鹽菌約占14.28%，未分離出邊界和極端嗜鹽菌(表3).依據(jù)獲得的種質(zhì)資源進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，中度嗜鹽菌和輕度嗜鹽菌應(yīng)為青海湖嗜鹽菌生長優(yōu)勢(shì)種群，青海湖相對(duì)偏低的鹽度環(huán)境為中度嗜鹽菌和輕度嗜鹽菌的長期進(jìn)化和適應(yīng)性生存提供了必要條件.

2.3 生長特性研究

從初步分離獲取的22株中度嗜鹽微生物中，選擇生長鹽度范圍較為寬泛，最適生長鹽度范圍較高的典型菌株15株，進(jìn)行生長特性研究，結(jié)果表明:青海湖中度嗜鹽微生物能在10～45℃溫度范圍生長，其中一些菌株甚至能在5℃生長，此與青海湖地處高原地區(qū)環(huán)境有關(guān)，水溫隨季節(jié)而變化(表4).青海湖區(qū)深居大陸腹地，屬典型的大陸性中緯度高海拔寒冷半干旱氣侯，7月份平均氣溫為12.4℃，極端最高溫度為28℃，1月份平均氣溫為 －12.7℃，極端最低氣溫達(dá) －30℃［15］.青海湖湖水 pH范圍為8.92～9.28［16］，所分離的中度嗜鹽微生物能在 pH為5.5～11.0的范圍內(nèi)生長，且最適 pH 均大于7.5，這與地區(qū)鹽堿化環(huán)境密切相關(guān)，具有嗜鹽兼性嗜堿的特性.因菌種屬性的差異，中度嗜鹽菌對(duì)Mg2+的生長需求不同，耐受程度亦不同，最大濃度達(dá)到1.6 mol/L.在優(yōu)化培養(yǎng)條件下，OD600達(dá)到1.20左右的培養(yǎng)時(shí)間為8～12 h.

表2 青海湖水體嗜鹽微生物生長鹽度和最適鹽度Tab.2 The growth salinity range and optimum salinity of halophile microorganisms in Lake Qinghai

表3 青海湖水體嗜鹽微生物分布情況Tab.3 The species distribution of halophile microorganisms in Lake Qinghai

表4 青海湖水體嗜鹽微生物生長特性Tab.4 The growth characteristics of halophile microorganisms in Lake Qinghai

2.4 碳氮源利用

對(duì)上述的15株典型中度嗜鹽菌株進(jìn)行碳氮源利用實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明大多數(shù)青海湖中度嗜鹽菌能以果糖、蔗糖、葡萄糖、麥芽糖、乳糖、半乳糖、木糖、鼠李糖、棉子糖、海藻糖和纖維二糖作為碳源，良好生長;其它碳源利用因菌株差異而不同.在氮源利用方面，大多數(shù)菌株能良好利用酵母抽提物、蛋白胨、硫酸銨、硝酸銨、氯化銨、尿素、硝酸鉀、硝酸鈉和硝酸鉀進(jìn)行生長;不能良好利用亞硝酸鈉生長(表5).

表5 青海湖中度嗜鹽微生物碳氮源利用情況Tab.5 The utilization of carbon and nitrogen sources by moderate halophile microorganisms in Lake Qinghai

3 討論與結(jié)論

從20份水樣中篩選分離出35株嗜鹽微生物，其中以中度嗜鹽菌為主，約占62.85%，輕度嗜鹽菌約占22.85%，非嗜鹽菌與耐鹽菌約占14.28%，未分離出邊界和極端嗜鹽菌，此與湖水鹽度環(huán)境密切相關(guān).青海湖水體鹽度為 13.24 ～14.05 g/L［17］，Na+濃度變化范圍是 2.56 ～7.08 g/L，平均值為 4.92 g/L［18］;Cl－濃度變化范圍是3.57～10.29 g/L，平均值為7.23 g/L［18］.國內(nèi)學(xué)者從南海、黃海、青島鹽田等區(qū)域，曾分離出邊界和極端嗜鹽菌，通過水體鹽度比較可知［19］:青海湖水體鹽度相對(duì)低于南中國海(33.2 g/L)和黃海(33.1 g/L)，此與青海湖湖水源補(bǔ)給密切相關(guān)，其來源主要是河水，其次是湖底的泉水和降水.從青海湖分離篩選的種質(zhì)資源分析表明，中度嗜鹽菌和輕度嗜鹽菌應(yīng)為生長優(yōu)勢(shì)種群，因青海湖相對(duì)偏低的鹽度環(huán)境，為中度嗜鹽菌和輕度嗜鹽菌的長期進(jìn)化和適應(yīng)性生存提供了必要條件.

青海湖中度嗜鹽菌能在10～45℃生長，其中一些菌株甚至能在5℃生長，與青海湖地處高原地區(qū)環(huán)境有關(guān)，但其生長速度相對(duì)緩慢，大部分菌株最適生長溫度在30～37℃之間.青海湖湖域溫度具有明顯的地域特征［20］:年最高氣溫為19.8 ～35.7℃，年最低氣溫為 －36.9 ～15.0℃，年平均氣溫為 －4.2 ～7.1℃，極端最低氣溫－33.4～－31℃.而且高原地區(qū)晝夜溫差變化顯著，青海湖嗜鹽菌對(duì)溫度適應(yīng)能力較強(qiáng)，生長溫度范圍較寬.所分離的中度嗜鹽菌能在pH為5.5～11的范圍內(nèi)生長，且最適pH均大于7.5，具有嗜鹽兼性嗜堿的特性.青海湖湖水的 pH 值范圍為8.90 ～9.09，均值為 9.05［16］;主要入湖河流 pH 范圍為 8.41 ～9.01，均值為8.56［16］，表明青海湖流域水質(zhì)呈堿性，可能與青海湖地區(qū)大氣降水和表層土壤都呈堿性有關(guān)，因此影響嗜鹽菌對(duì)堿性環(huán)境的耐受.水體中陽離子以Na+、K+、Mg2+為主，Ca2+含量偏少，但Mg2+/Ca2+比值較大，此與青海湖大量的方解石和文石沉積有關(guān)［21］.陰離子主要有Cl－、SO2－4、NO－3和HCO－3，以Cl－為主，屬典型的大陸內(nèi)陸水體特征［16］.因此，菌種種屬的差異導(dǎo)致中度嗜鹽菌對(duì)Mg2+的生長需求不同，耐受程度亦不同，最大濃度達(dá)到1.6 mol/L，其中一些菌株依賴Mg2+的存在而生長代謝，即使是極低濃度Mg2+.大多數(shù)青海湖中度嗜鹽菌能以果糖、蔗糖、葡萄糖、麥芽糖、乳糖、半乳糖、木糖、鼠李糖、棉子糖、海藻糖和纖維二糖作為碳源，生長良好.在氮源利用方面，大多數(shù)菌株能良好利用有機(jī)氮源、銨鹽、硝酸鹽進(jìn)行生長，但大多數(shù)菌株不能利用亞硝酸鹽.近年來，青海湖中硝酸鹽含量逐年呈上升趨勢(shì)，為微生物生長提供良好的氮源條件;青海湖流域河流 DOC 含量為 6.35 ～12.65 mg/L，平均濃度為 10.5 mg/L［18］，湖水 DOC 含量為 334.26 ～518.82 mg/L，平均濃度為453.7 mg/L［18］，為湖邊域微生物的生長和繁殖提供了充足的營養(yǎng)基質(zhì).

青藏高原地區(qū)特殊的氣候條件和自然地理?xiàng)l件造就了青海湖典型的高原鹽湖沉積環(huán)境和湖泊相對(duì)封閉水體，且沉積物和湖域周邊牧區(qū)豐富的有機(jī)物質(zhì)為微生物的生長代謝提供了充足的養(yǎng)料.通過獲得的青海湖嗜鹽菌種質(zhì)資源，初步研究其生長特性，以此了解青海湖嗜鹽微生物的多樣性，為后續(xù)青海湖微生物生態(tài)學(xué)、種群系統(tǒng)發(fā)育和進(jìn)化定位分析等研究工作奠定堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ).

［1］李迪強(qiáng)，蔣志利，王祖望.青海湖地區(qū)生物多樣性的空間特征與GAP分析.自然資源學(xué)報(bào)，1999，14(1):47-53.

［2］山發(fā)壽，杜乃秋，孔昭宸.青海湖盆地35萬年來的植被演化及環(huán)境變遷.湖泊科學(xué)，1993，5(1):9-17.

［3］趙百鎖，楊禮富，宋 蕾等.中度嗜鹽菌在生物技術(shù)中的應(yīng)用.微生物學(xué)通報(bào)，2007，34(2):359-362.

［4］張小華，陳皓文.海洋原核生物名稱.北京:科學(xué)出版社，2009:1-2.

［5］George MG，Julia AB，Timothy GL.Taxonomic outline of the prokaryotes Bergey’s manual of systematic bacteriology:2nd edition.New York:Berlin Heidelberg，2004:19-22.

［6］迪麗拜爾·托乎提.新疆羅布泊周邊地區(qū)極端環(huán)境嗜鹽菌的研究.生物技術(shù)，2009，19(5):16-20.

［7］陳志亮，陳榮忠.南極深海底泥中度嗜鹽菌鹽單胞菌屬Nj223ectC基因的克隆表達(dá)及ectoine合成酶性質(zhì)分析.微生物學(xué)報(bào)，2007，47(2):363-365.

［8］崔春曉，戴美學(xué)，夏志潔.鹽地堿蓬內(nèi)生中度嗜鹽菌的分離與系統(tǒng)發(fā)育多樣性分析.微生物學(xué)通報(bào)，2010，37(2):204-210.

［9］周旭華，吳 敏.舟山地區(qū)26株嗜鹽菌的系統(tǒng)發(fā)育分析.現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，16(4):44-45.

［10］徐曉紅，吳 敏.嗜鹽古生菌AJ6的分離及系統(tǒng)發(fā)育分析.浙江大學(xué)學(xué)報(bào)，2005，32(1):83-87.

［11］張曉梅.一株產(chǎn)脂肪酶嗜鹽菌的鑒定及耐鹽機(jī)理.應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報(bào)，2010，16(1):100-103.

［12］東秀珠，蔡妙英.常用細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè).北京:科學(xué)出版社，2001:364-370.

［13］布坎南RE，吉本斯NE.伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè):第8版.北京:科學(xué)出版社，1984:353-357.

［14］曹衛(wèi)軍，沈 萍，李朝陽.嗜極微生物.武漢:武漢大學(xué)出版社，2004:1-19.

［15］淮虎銀，周立華.青海湖湖盆南岸植物群落的生態(tài)優(yōu)勢(shì)度與海拔梯度.西北植物學(xué)報(bào)，1995，15(3):240-243.

［16］侯昭華，徐 海，安芷生.青海湖流域水化學(xué)主離子特征及控制因素初探.地球與環(huán)境，2009，37(1):11-19.

［17］張恩樓，沈 吉，王蘇民.近0.9 ka來青海湖湖水鹽度的定量恢復(fù).科學(xué)通報(bào)，2004，49(7):697-701.

［18］張 琨，藍(lán)江湖，沈振興等.青海湖流域水化學(xué)分析及水質(zhì)初步評(píng)價(jià).地球環(huán)境學(xué)報(bào)，2010，(3):162-168.

［19］妥進(jìn)才，陳 駿，姚素平等.青海湖:研究地質(zhì)微生物的天然實(shí)驗(yàn)室.高校地質(zhì)學(xué)報(bào)，2005，11(2):187-193.

［20］孫永亮，李小雁，湯 佳.青海湖流域氣候變化及其水文效應(yīng).資源科學(xué)，2008，30(3):653-655.

［21］劉興起，沈 吉，王蘇民等.16 ka以來青海湖湖相自生碳酸鹽沉積記錄的古氣候.高校地質(zhì)學(xué)報(bào)，2003，9(1):38-46.

Isolation and characteristics of halophile microorganisms from Lake Qinghai

SHEN Guoping1，ZHU Derui1，LIU Jian2，HAN Rui3＆ LONG Qifu1
(1:Medical Cuollege，Qinghai University，Xining 810016，P.R.China)
(2:College of Life Science，Huazhong Normal University，Wuhan 430079，P.R.China)
(3:Provincial Agricultural Academy of Science，Qinghai University，Xining 810016，P.R.China)

The main objective of the project is to obtain completely halophile germplasm resources from Lake Qinghai，to construct stocks phyletic evolution tree of halophilic bacterium and determine the evolution position.35 strains were isolated from 20 water samples taken from Lake Qinghai using the high salty medium.Resistant to salt gradient experiment shows that moderate halophilic bacteria account for about 62.85%in the water，mild halophilic bacteria account for about 22.85%，non halophilic bacteria and salt resistance bacteria account for 14.28%.Moderate halophilic bacteria could grow in the temperature of 10 ～45℃ and pH 5.5～11.0，which is related to the local salinization environment and has characteristic of hasophilic microorganisms.

Lake Qinghai;halophile microorganisms;isolation;characteristics

＊ 國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31060013)資助.2011－03－18收稿;2011－08－02收修改稿.沈國平，女，1976年生，副教授;E-mail:sgpkkll@126.com.

＊＊ 通信作者;E-mail:zhuderui2005@126.com.