何晨光 趙莉

靜電紡絲技術(shù)是一種制備納米纖維的最簡單的方法。通過靜電紡絲技術(shù)，可以獲得纖維直徑均一，成分多樣的超長纖維[1-2]。靜電紡絲是一種利用聚合物溶液或熔體在強(qiáng)電場作用下，形成噴射流進(jìn)行紡絲加工的工藝[3-4]。與其他方法相比，靜電紡絲技術(shù)制備的納米纖維支架因具有較大的比表面積，較強(qiáng)的力學(xué)性能和較高的孔隙率，而更接近細(xì)胞外基質(zhì)的結(jié)構(gòu)。因此，靜電紡絲技術(shù)被廣泛應(yīng)用于組織工程的支架材料領(lǐng)域[5-7]。

殼聚糖是甲殼素部分脫乙?；苌?，它是由β(1～4)相連的D-葡聚胺與含量不等的N-乙酰葡聚胺無規(guī)排列起來的一種線性聚糖的多聚糖[8]。殼聚糖無毒，抗菌，具有良好的生物降解性能，可作為傷口敷料，能有效防止黏連，促進(jìn)傷口愈合[9]。明膠是通過膠原部分水解而得到的，是膠原的變性產(chǎn)物。明膠的化學(xué)成分和膠原類似，作為一種蛋白質(zhì)，明膠由一組氨基酸單鏈組成，可用于膨脹劑、傷口敷料、粘結(jié)劑和外科用可吸收墊片等[10]。明膠具有良好的生物相容性和生物可降解性，并且沒有免疫原性；同時(shí)，明膠含有豐富的氨基和羧基親水基團(tuán)，有助于營養(yǎng)成分和氧氣的滲入。殼聚糖和明膠被廣泛應(yīng)用于皮膚組織工程支架材料中[11-13]。用靜電紡絲技術(shù)制備殼聚糖和明膠復(fù)合纖維支架，可以充分發(fā)揮殼聚糖抗菌和防黏連的特性，以及明膠吸水和防滲出的特性，模擬皮膚的結(jié)構(gòu)，促進(jìn)傷口愈合，滿足組織工程皮膚支架材料的要求。

我們采用靜電紡絲技術(shù)制備殼聚糖－明膠復(fù)合纖維支架，研究紡絲參數(shù)對支架纖維結(jié)構(gòu)的影響，并將人皮膚成纖維細(xì)胞接種在支架材料上，觀察細(xì)胞的形態(tài)以及細(xì)胞在支架材料上的生長情況，探討殼聚糖－明膠復(fù)合纖維支架作為皮膚組織工程支架材料的可行性。

1 材料及方法

1.1 材料

殼聚糖（CS，Medium molecular weight，Sigma-Aldrich）；明膠（GE，國藥集團(tuán)試劑有限公司）；三氟乙酸（TFA，CP），二氯甲烷（DCM），醋酸，乙二醇和氫氧化鈉（NaOH）購自國藥集團(tuán)試劑有限公司，分析級。 戊二醛（Gultaraldehyde，Grade-I，Sigma-Aldrich）。

DMEM（High Glucose，HyClone）；FBS（Fetal Bovine Serum，SAFC Biosciencestm）；CCK-8(Cell Counting Kit-8，DojinDo)。

1.2 纖維支架制備

1.2.1 殼聚糖纖維支架制備

以體積比為5∶1的三氟乙酸與二氯甲烷混合溶液為溶劑，配制濃度為3～5 wt%的殼聚糖溶液，在16～20 KV范圍內(nèi)調(diào)節(jié)電壓，并在0.4～2.0 mL/h范圍內(nèi)調(diào)節(jié)流速。收集、干燥后獲得具有不同表面形貌的殼聚糖纖維支架。

1.2.2 明膠纖維支架的制備

以體積比為9.5∶1的醋酸與乙二醇混合溶液為溶劑，配制不同濃度明膠溶液，在13～20 KV范圍內(nèi)調(diào)節(jié)電壓，并在流速為0.4 mL/h條件下進(jìn)行紡絲。收集、干燥后獲得具有不同表面形貌的明膠纖維支架。

1.2.3 殼聚糖－明膠復(fù)合纖維支架制備

以體積比為7∶1的三氟乙酸與二氯甲烷為溶劑，首先加入殼聚糖，攪拌形成均一的殼聚糖溶液；按比例加入明膠，繼續(xù)攪拌，配制成濃度為6 wt%的殼聚糖/明膠混合溶液。調(diào)節(jié)電壓和紡絲間距，在電場強(qiáng)度為1.8 KV/cm，流速為1.0 mL/h條件下進(jìn)行靜電紡絲。為觀察不同配比殼聚糖/明膠復(fù)合纖維支架的性能，殼聚糖/明膠的質(zhì)量比分別設(shè)為1∶3、1∶1和3∶1。收集、干燥后獲得具有不同表面形貌的殼聚糖-明膠纖維支架。

1.3 纖維支架的交聯(lián)

將濃度為25%的5 mL戊二醛溶液置于密閉干燥器，放入纖維支架，用戊二醛蒸氣交聯(lián)3 h，再放入100℃真空烘箱內(nèi)，抽真空干燥1 h，去除殘留的戊二醛，干燥結(jié)束后將支架放入干燥器。

為使支架在液體環(huán)境中更好的保持其纖維結(jié)構(gòu)，交聯(lián)后的纖維支架用0.5 M/L的NaOH溶液浸泡30min，再以去離子水洗至液體呈中性。

1.4 支架的表征

纖維支架的形貌用掃描電鏡來進(jìn)行觀察。分別取支架樣品，表面經(jīng)離子濺射儀噴金鍍膜后，用Hitachi S-450掃描電鏡觀察支架的表面形貌。采用圖像分析軟件測定掃描電鏡照片中支架的纖維直徑，每個(gè)樣品的電鏡照片取30根纖維計(jì)算平均直徑。

Analysis of Influencing Factors on Fatigue of Offshore Wind Turbine Monopile Foundation WANG Hongqing,LIU Xudong,BI Mingjun,LIU Jinchao(92)

1.5 細(xì)胞接種

選擇殼聚糖/明膠質(zhì)量比為3∶1的復(fù)合纖維支架，將支架材料裁成1.5 cm×1.5 cm大小，75%醫(yī)用乙醇浸泡1 h，然后用磷酸鹽緩沖液（Phosphate buffered solution，PBS）沖洗3次，加入細(xì)胞培養(yǎng)液（含10%胎牛血清的 DMEM），置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)浸潤過夜，接種細(xì)胞前將材料移至6孔板。

原代培養(yǎng)的人真皮成纖維細(xì)胞體外傳代培養(yǎng)至第5代，待細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)皿底部時(shí)，用0.25%胰酶消化，按3×105cells/cm2的密度接種于材料表面，待細(xì)胞黏附4h后，加入足量的細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)，隔天換液。

1.6 細(xì)胞在纖維支架材料上的形貌

細(xì)胞接種后第3、5、7天，取出細(xì)胞-材料復(fù)合物，用PBS輕輕沖洗2次，放入2.5%戊二醛溶液中，4℃固定24h，再用六甲基二硅胺烷逐級脫水干燥。采用SEM觀察細(xì)胞在支架表面的形貌。

1.7 細(xì)胞在纖維支架材料上的增殖

用CCK-8試劑定量檢測細(xì)胞材料復(fù)合物上活細(xì)胞數(shù)量，并繪制生長曲線，觀察其增殖情況。將材料剪裁成1.5 cm×1.5 cm的尺寸，75%醫(yī)用乙醇浸泡后，PBS沖洗3次，然后放入24孔板。每塊材料接種1.4×104個(gè)細(xì)胞，加入適量細(xì)胞培養(yǎng)液置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。 分別于接種后第 1、3、5、7、9天吸去培養(yǎng)液，每孔加入100μL CCK-8溶液，放入37℃烘箱孵育2 h，取上清液加入96孔板，測定在450 nm處的吸光度值，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[14]。

2 結(jié)果

2.1 殼聚糖纖維支架的形貌

殼聚糖纖維支架的制備參數(shù)及對應(yīng)的纖維直徑如表1。

2.1.1 電壓對纖維支架形貌的影響

2.1.2 濃度對纖維形貌的影響

濃度對纖維直徑有明顯的影響。由表1可知，隨著濃度的增加，纖維直徑從（0.53±0.26）μm，增加至（0.8±0.29） μm，當(dāng)濃度為 4.3 wt%時(shí)，纖維直徑增加至（1.2±0.3）μm。濃度增加，殼聚糖溶液成纖效果差，大多數(shù)纖維粘結(jié)在一起，纖維間一些直徑較小的纖維在干燥過程中發(fā)生斷裂（圖2）。

2.2 明膠纖維支架的形貌

明膠纖維支架的制備參數(shù)及纖維直徑如表2所示。當(dāng)保持其他參數(shù)不變時(shí)，隨著紡絲溶液濃度增加，纖維直徑隨之增加。溶液濃度從19.4 wt%增加到 24.6 wt%時(shí)，纖維直徑由（0.224±0.06）μm 增加至（0.87±0.18）μm。但紡絲溶液濃度在19.4 wt%和22 wt%之間變化時(shí)，纖維直徑變化不大，反而隨著濃度增加，直徑略有降低。

紡絲時(shí)，電壓增加，明膠纖維的直徑略有增大。當(dāng)電壓從13 KV增加至20 KV時(shí)，纖維直徑從（0.19±0.06） μm 增大至（0.217±0.08） μm（圖 3）。

2.3 殼聚糖－明膠復(fù)合纖維支架

殼聚糖－明膠復(fù)合纖維支架的制備參數(shù)及性能參數(shù)如表3所示。殼聚糖/明膠質(zhì)量比增加時(shí)，溶液粘度變大；殼聚糖/明膠質(zhì)量比增加時(shí)，纖維粘連增多，纖維支架孔隙變小，更加致密。而且，當(dāng)殼聚糖含量增加時(shí)，雖然溶液濃度保持不變，但纖維直徑仍然顯著增加（圖 4，5）。

2.4 細(xì)胞在纖維支架上的形貌

成纖維細(xì)胞接種在殼聚糖－明膠復(fù)合纖維支架（殼聚糖/明膠質(zhì)量比為 3∶1）上，培養(yǎng) 3 d后，細(xì)胞已基本鋪滿整個(gè)支架表面，透過細(xì)胞層間隙，還可見到纖維。細(xì)胞呈典型的梭狀，細(xì)胞基質(zhì)分泌旺盛。培養(yǎng)5 d后，支架表面難以看到露出的纖維，細(xì)胞基質(zhì)更加豐富，細(xì)胞形態(tài)更加伸展（圖6）。培養(yǎng)7 d后，由于細(xì)胞層增厚，掃描電鏡觀察時(shí)，電子束強(qiáng)，樣品放電嚴(yán)重，結(jié)果無法顯示。

2.5 細(xì)胞在纖維支架上的增殖

細(xì)胞接種在材料上后，前3 d增殖不明顯，細(xì)胞數(shù)量沒有快速增加。接種3 d后，細(xì)胞在3種比例纖維支架上都開始生長，并在5 d后進(jìn)入快速增長期。殼聚糖/明膠質(zhì)量比為1∶1的復(fù)合纖維支架組，培養(yǎng)7 d后，細(xì)胞生長進(jìn)入平臺(tái)期，增殖緩慢。而另外兩種比例的纖維支架上，培養(yǎng)到第9天，細(xì)胞仍然在不斷增殖，尤其是殼聚糖/明膠質(zhì)量比為3∶1的復(fù)合纖維支架，7 d后，細(xì)胞在支架上的增殖速度更是超過了質(zhì)量比為1∶3的復(fù)合纖維支架（圖7）。

表1 殼聚糖纖維支架制備參數(shù)及纖維直徑Table 1 Preparation parameters and fiber diameter of chitosan fibers

圖1 電壓對殼聚糖纖維支架形貌的影響。紡絲溶液濃度為3.7 wt%，流速為0.4 mL/h，紡絲間距為10 cm；A：電壓為16 KV；B：電壓為20 KVFig.1 Influence of votage on chitosan fibers at the concentration of 3.7 wt%,a feeding rate of 0.4 ml/h,a tip-target distance of 10cm with the different applied voltages of(A)16 KV;(B)20 KV

圖2 殼聚糖纖維支架SEM觀察，紡絲過程中電壓為20 KV，溶液流速為0.4 mL/h。A：濃度為3.7 wt%；B：濃度為4 wt%；C：濃度為4.3 wt%Fig.2 SEM micrograph of the chitosan fibers at the applied voltage of 20 KV,a feeding rate of 0.4 mL/h with different concentrations of(A)3.7 wt%;(b)4 wt%;(c)4.3 wt%

表2 明膠纖維支架制備參數(shù)及纖維直徑Table 2 Preparation parameters and fiber diameter of gelatin fibers

圖3 不同制備參數(shù)下的明膠纖維支架的SEM觀察。溶液流速為0.4 mL/h，紡絲間距為10 cm。A：濃度為19.4 wt%，電壓為13 KV；B：濃度為22 wt%，電壓為13 KV；C：濃度為24.6 wt%，電壓為13 KV；D：濃度為22 wt%，電壓為20 KVFig.3 SEM micrograph of the gelatin fibers at a feeding rate of 0.4 mL/h with the tip-target distance of 10cm with different concentrations and applied voltages of(A)19.4 wt%,13 KV;(B)22 wt%,13 KV;(C)24.6 wt%,13 KV;(D)22 wt%,20 KV

表3 殼聚糖－明膠復(fù)合纖維支架的制備參數(shù)及性能參數(shù)Table 3 Preparation and performance parameters of chitosan/gelatin composite fibers

圖4 殼聚糖/明膠質(zhì)量比對纖維平均直徑和溶液粘度的影響Fig.4 Influence of chitosan/gelatin ratios on the average fiber diameter and solution viscosity

圖5 不同配比殼聚糖－明膠復(fù)合纖維支架的SEM照片F(xiàn)ig.5 SEM micrograph of the electrospun chitosan/gelatin composite fibers in different mass ratios

圖6 成纖維細(xì)胞接種在殼聚糖-明膠復(fù)合纖維支架上，培養(yǎng)3 d（A）和5 d（B）后，細(xì)胞在支架上的鋪展形態(tài)Fig.6 Cell morphology on the chitosan/gelatin composite fibrous scaffolds after the culture of 3 days(A)and 5 days(B)

圖7 人成纖維細(xì)胞在3種不同殼聚糖/明膠質(zhì)量比纖維支架上的增殖情況Fig.7 Proliferation curve of human fibroblast cultured in the chitosan/gelatin composite fibrous scaffolds

3 討論

靜電紡絲技術(shù)自1934年Formalas發(fā)明專利以來，近幾十年得到飛速發(fā)展。迄今為止，有近百種聚合物通過靜電紡絲技術(shù)紡制成纖維，陶瓷材料如羥基磷灰石[15]、生物活性玻璃[16]等，復(fù)合材料如PCL/CaCO3[17]、HA/PVP[18]、聚乳酸/硅酸鈣[19]等，也都在不同的參數(shù)下制備出納米纖維。靜電紡絲技術(shù)獲得的纖維直徑從毫米級到納米級，可滿足不同的需要[20]。由于靜電紡絲制備的纖維類似細(xì)胞外基質(zhì)，故而在組織工程支架材料方面得到廣泛應(yīng)用。

殼聚糖和明膠是皮膚組織工程支架常用的材料，過去常用的支架制備方法是冷凍干燥法[21-23]。靜電紡絲技術(shù)的出現(xiàn)，為皮膚組織工程支架的制備提供了一種新的方法[24-31]。本實(shí)驗(yàn)采用三氟乙酸和二氯甲烷混合溶劑，制備無珠狀結(jié)構(gòu)的殼聚糖-明膠復(fù)合纖維支架，著重對3種不同質(zhì)量比的復(fù)合支架進(jìn)行研究，并利用人成纖維細(xì)胞觀察復(fù)合纖維支架的體外相容性。

我們首先制備了殼聚糖纖維和明膠纖維。在選擇溶劑時(shí)，醋酸是首選。但是在紡制殼聚糖纖維時(shí)，發(fā)現(xiàn)醋酸揮發(fā)性差，難以獲得理想的纖維支架。明膠對溶劑的適應(yīng)性強(qiáng)，當(dāng)以醋酸和乙二醇為溶劑時(shí)，紡絲溶液濃度可接近25 wt%。對于殼聚糖纖維支架而言，選擇三氟乙酸和二氯甲烷混合溶液為溶劑，制備出的纖維均勻，無珠滴。三氟乙酸揮發(fā)性好，溶解能力強(qiáng)，可以和殼聚糖中帶正電的氨基基團(tuán)形成鹽，從而破壞殼聚糖分子間的相互作用，因而使得殼聚糖溶液具有很好的流動(dòng)性[30]。然而，即使以三氟乙酸和二氯甲烷為溶劑，可紡絲的殼聚糖溶液濃度仍然低于5 wt%，溶液黏度不超過2 Pa.s。溶液濃度過高，黏度太大，溶液推進(jìn)困難，而且增加電壓，也難以克服溶液的表面張力，從針頭出來的溶液黏結(jié)在一起，造成多股纖維粘結(jié)。明膠溶液流動(dòng)性好，黏度低，可在很大濃度范圍內(nèi)進(jìn)行紡絲。

紡絲溶液濃度是影響纖維質(zhì)量和纖維直徑的主要因素，電壓是另一個(gè)影響因素。電壓偏低時(shí)，噴射流不能形成，容易在收集板上出現(xiàn)液滴。我們所施加的電壓均是能夠形成連續(xù)均一的纖維。電壓增加，可以形成噴射流，并克服液滴的表面張力，使之形成Taylor錐，最后纖維收集在收集板上。本研究中，電壓增加，纖維直徑略有增大，但沒有顯著差異。這是因?yàn)殡妷涸黾訒r(shí)，紡絲溶液從針頭到達(dá)收集板的時(shí)間縮短，纖維在形成Taylor錐的過程中沒有經(jīng)過充分的牽伸，因此纖維直徑略有增大。與紡絲溶液濃度對纖維直徑的影響相比，電壓對纖維直徑的影響較小。

殼聚糖和明膠復(fù)合時(shí)，在同樣的濃度下，復(fù)合溶液的黏度隨著明膠含量的增加而減小，同時(shí)復(fù)合纖維直徑也相應(yīng)減小。本研究選擇了3種殼聚糖/明膠質(zhì)量比，均獲得無珠滴、纖維均一的復(fù)合纖維支架。殼聚糖大分子中，NH2+和OH-基團(tuán)對形成很強(qiáng)的氫鍵相互作用具有重要意義。加入明膠后，明膠的螺旋微結(jié)構(gòu)可使殼聚糖鏈段之間的分子間相互作用降低，從而在功能鍵間形成氫鍵。由于這些鍵比殼聚糖本身的功能鍵弱，因而殼聚糖/明膠復(fù)合溶液的黏度降低，在靜電紡絲時(shí)更容易形成Taylor錐，從而獲得均一、超細(xì)且無珠滴的復(fù)合纖維[31]。

殼聚糖和明膠都是具有良好生物相容性的天然高分子材料。我們在前期的研究中，將殼聚糖和明膠復(fù)合，制備出用于表皮細(xì)胞生長的膜片。結(jié)果顯示，細(xì)胞在膜片上增殖良好，可用于修復(fù)裸鼠創(chuàng)面和瘢痕的治療[32-33]。本研究中，來源于小兒包皮的人成纖維細(xì)胞經(jīng)傳代后，接種于殼聚糖－明膠復(fù)合纖維支架，培養(yǎng)3 d后，細(xì)胞已鋪滿大部分的支架表面，說明靜電紡絲殼聚糖－明膠復(fù)合纖維支架具有良好的細(xì)胞相容性。細(xì)胞在支架表面鋪展良好，呈典型的梭狀，而且隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，增殖良好；培養(yǎng)5 d后，細(xì)胞數(shù)量進(jìn)一步增加，支架表面已全部被細(xì)胞鋪滿；培養(yǎng)7 d后，由于細(xì)胞數(shù)量增加，細(xì)胞層增厚，SEM觀察時(shí)，樣品放電現(xiàn)象嚴(yán)重，沒有結(jié)果顯示。細(xì)胞增殖曲線進(jìn)一步驗(yàn)證了這一點(diǎn)。該結(jié)果證明成纖維細(xì)胞在殼聚糖－明膠復(fù)合纖維支架上生長良好，殼聚糖－明膠復(fù)合纖維支架是潛在的皮膚組織工程支架材料。

4 結(jié)論

本研究以三氟乙酸和二氯甲烷為溶劑，紡絲電壓為18 KV、流速為1 mL/h，紡絲溶液濃度為6 wt%，獲得的復(fù)合纖維支架具有均一、光滑、無珠滴的纖維形貌。隨著紡絲溶液濃度的增加，纖維平均直徑隨之增加。在其他參數(shù)保持不變的條件下，殼聚糖/明膠質(zhì)量比增加，紡絲溶液黏度增加，平均纖維直徑也隨之增加。電壓對纖維直徑?jīng)]有顯著影響。將人成纖維細(xì)胞接種在殼聚糖－明膠復(fù)合纖維支架上，細(xì)胞生長良好，增殖快。本研究制備的殼聚糖－明膠復(fù)合纖維支架具有良好的生物相容性，有望作為皮膚組織工程支架材料。

[1]Li D,Xia YN.Electrospinning of nanofibers:Reinventing the wheel[J]?Adv Mater,2004,16(14):1151-1170.

[2]Li D,Wang Y,Xia Y.Electrospinning nanofibers as uniaxially aligned arrays and layer-by-layer stacked films[J].Adv Mater,2004,16(4):361-366

[3]Huang ZM,Zhang YZ,Kotaki M,et al.A review on polymer nanofibers by electrospinning and their application in nanocomposites[J].Compos Sci Technol,2003,63(15):2223-2253.

[4]Liao S,Li B J,Ma Z,et al.Biomimetic electrospun nanofibers for tissue regeneration[J].Biomed Mater,2006,1(3):R45-53.

[5]Li WJ,Laurencin CT,Caterson EJ,et al.Electrospun nanofibrous structure:a novel scaffold for tissue engineering[J].J Biomed Mater Res,2002,60(4):613-621.

[6]Yoshimoto H,Shin YM,Terai H,et al.A biodegradable nanofiber scaffold by electrospinning and its potential for bone tissue engineering[J].Biomaterials,2003,24(12):2077-2082.

[7]Bhattarai SR,Bhattarai N,Yi HK,et al.Novel biodegradable electrospun membrane:scaffold for tissue engineering[J].Biomaterials,2004,25(13):2595-2602.

[8]朱愛萍,吳鈞,張娜,等.殼聚糖——一種具有應(yīng)用潛力的組織工程支架材料[J].化學(xué)通報(bào),2002,65(1):w003

[9]Jayakumar R,Prabaharan M,Nair SV,et al.Novel chitin and chitosan nanofibers in biomedical applications[J].Biotechnol Adv,2010,28(1):142-510.

[10]Jafari J,Emami SH,Samadikuchaksaraei A,et al.Electrospun chitosan-gelatin nanofiberous scaffold:Fabrication and in vitro evaluation[J].Biomed Mater Eng,2011,21(2):99-112.

[11]Tchemtchoua VT,Atanasova G,Aqil A,et al.Development of a chitosan nanofibrillar scaffold for skin repair and regeneration[J].Biomacromolecules,2011,12(9):3194-3204.

[12]Chen JP,Chang GY,Chen JK.Electrospun collagen/chitosan nanofibrous membrane as wound dressing[J].Colloids Surf A Physicochem Eng Asp,2008,313-314:183-188.

[13]Lee SB,Kim YH,Chong MS,et al.Study of gelatin-containing artificial skin V:fabrication of gelatin scaffolds using a salt-leaching method[J].Biomaterials,2005,26(14):1961-1968.

[14]Kim D,Kim S,Jo S,et al.Effect of cross-linking spacers on biocompatibility of chitosan-spacer-poly(ethylene oxide)hydrogel[J].Macromolecular Research,2011,19(6):573-581.

[15]Kim HW,Kim HE.Nanofiber generation of hydroxyapatite and fluor-hydroxyapatite bioceramics[J].J Biomed Mater Res B Appl Biomater,2006,77(2):323-328.

[16]Xia W,Zhang D,Chang J.Fabrication and in vitro biomineralization of bioactive glass(BG)nanofibres[J].Nanotechnology,2007,18(13):135601.

[17]Fujihara K,Kotaki M,Ramakrishna S.Guided bone regeneration membrane made of polycaprolactone/calcium carbonate composite nano-fibers[J].Biomaterials,2005,26(19):4139-4147.

[18]Chen F,Tang QL,Zhu YJ,et al.Hydroxyapatite nanorods/poly(vinyl pyrolidone)composite nanofibers,arrays and three-dimensional fabrics:electrospun preparation and transformation to hydroxyapatite nanostructures[J].Acta Biomater,2010,6(8):3013-3020.

[19]Dou Y,Wu C,Chang J.Preparation,mechanical property and cytocompatibility of poly(l-lactic acid)/calcium silicate nanocomposites with controllable distribution of calcium silicate nanowires[J].Acta Biomater,2012,8(11):4139-4150.

[20]Huang ZM,Zhang YZ,Ramakrishna S,et al.Electrospinning and mechanical characterization of gelatin nanofibers[J].Polymer,2004,45(15):5361-5368.

[21]Sundararajan VM,Howard WTM.Porous chitosan scaffolds for tissue engineering[J].Biomaterials,1999,20(12):1133-1142

[22]Ho MH,Kuo PY,Hsieh HJ,et al.Preparation of porous scaffolds by using freeze-extraction and freeze-gelation methods[J].Biomaterials,2004,25(1):129-138.

[23]Kang HW,Tabata Y,Ikada Y.Fabrication of porous gelatin scaffolds for tissue engineering[J].Biomaterials,1999,20(14):1339-1344.

[24]Matsuda A,Kagata G,Kino R,et al.Preparation of chitosan nanofiber tube by electrospinning[J].J Nanosci Nanotech,2007,7(3):852-855.

[25]Jayakumar R,Prabaharan M,Nair SV,et al.Novel chitin and chitosan nanofibers in biomedical applications[J].Biotechnol Adv,2010,28(1):142-150

[26]Min BM,Lee SW,Lim JN,et al.Chitin and chitosan nanofibers:electrospinning of chitin and deacetylation of chitin nanofibers[J].Polymer,2004,45(21):7137-7142.

[27]Powell HM,Boyce ST.Fiber density of electrospun gelatin scaffolds regulates morphogenesis of dermal–epidermal skin substitutes[J].J Biomed Mater Res A,2008,84(4):1078-1086.

[28]Song JH,Kim HE,Kim HW.Production of electrospun gelatin nanofiber by water-based co-solvent approach[J].J Mater Sci Mater Med,2008,19(1):95-102.

[29]Sisson K,Zhang C,Farach-Carson MC,et al.Fiber diameters control osteoblastic cell migration and differentiation in electrospun gelatin[J].J Biomed Mater Res A,2010,94(4):1312-1320.

[30]Dhandayuthapani B,Krishnan UM,Sethuraman S.Fabrication and characterization of chitosan-gelatin blend nanofibers for skin tissue engineering[J].J Biomed Mater Res B Appl Biomater,2010,94(1):264-272.

[31]He JH,Wan YQ,Yu JY.Application of vibration technology to polymer electrospinning[J].Int J Nonlinear Sci Numer Simul,2004,5(3):253-262.

[32]楊光輝,楊軍,鄧辰亮,等.組織工程化表皮膜片修復(fù)裸鼠創(chuàng)面的實(shí)驗(yàn)研究[J].上海第二醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2004,24（4）:293-295.

[33]楊軍,楊光輝,劉偉,等.組織工程化表皮膜片的構(gòu)建及其在增殖性疤痕治療中的應(yīng)用[J].上海第二醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2004,24（4）:296-298.