邱志東 繆輝來 雷長江 劉忠考 黎 然 包仕廷

廣東醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院肝膽外科，廣東湛江 524001

磷脂酰肌醇蛋白聚糖3（Glypican-3，GPC3）被發(fā)現(xiàn)常在肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）中高表達(dá)，在HCC的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用[1-2]。RNA干擾（RNA interference，RNAi）目前是一種成熟的研究基因功能的方法[3]，本研究先設(shè)計特異靶向GPC3的siRNAs，然后進(jìn)行篩選，并進(jìn)一步驗(yàn)證有效抑制GPC3表達(dá)后對肝癌細(xì)胞增殖能力的影響，以此探討GPC3在HCC中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

肝癌細(xì)胞Huh7（南方醫(yī)科大學(xué)病理研究所），DMEM、lipofectamine 2000和Trizol（Invitrogen），RT-PCR試劑盒（TaKaRa），SYBR Green PCR Master Mix（Toyobo），GPC3一抗和二抗（Novus Biologicals）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

Huh7細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清和雙抗的高糖DMEM中，置于37℃、含5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，用0.25%的胰酶進(jìn)行消化、傳代。

1.3 siRNA設(shè)計合成

根據(jù)GPC3（Genbank號：NM_001164617）的序列，運(yùn)用在線設(shè)計工具siSearch和sFold設(shè)計合成靶向GPC3的siRNA，并交由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成，序列如下：

表1 siRNA序列

1.4 siRNA轉(zhuǎn)染

轉(zhuǎn)染前1天，細(xì)胞接種6孔板，接種濃度為1×105個細(xì)胞/mL，每孔1 mL；第2天當(dāng)細(xì)胞匯合度達(dá)到70%左右時進(jìn)行轉(zhuǎn)染，步驟參考說明書進(jìn)行，siRNA終濃度設(shè)3個梯度為25 nmol（/L·孔）、50 nmol（/L·孔）、75 nmol（/L·孔）；4～6 h后，更換完全培養(yǎng)基，72 h后進(jìn)行后續(xù)檢測。

1.5 熒光定量PCR檢測

收集細(xì)胞，加入1 mL Trizol提取總RNA，定量后用1μg RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，SYBR-Green染料法進(jìn)行定量PCR，20μL體系含100 ng cDNA。反應(yīng)條件為：95℃ 5 min；95℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 30 s，40 cycles。每個樣做 3個重復(fù)，定量分析通過比較 2-ΔΔCt值進(jìn)行。GPC3 和內(nèi)參 GAPDH 定量所用引 物 為：GPC3-F：5'-AGAAACCTTATCCAGCCGAAGAA-3’；GPC3-R：5'-TGGGTCCAACTACTAAGCT-3’。GAPDH-F：5'-GGTATCGTGGAAGGACTC-3’；GAPDH-R：5'-GTAGAGGCAGGGATGATG-3’。

1.6 Western Blot

細(xì)胞收集后用PBS洗滌2次，加入含蛋白酶抑制劑的RIPA buffer（1X PBS，1% NP-40，0.1% SDS，5 mmol/L EDTA，0.5%脫氧膽酸鈉和1 mmol/L正釩酸鈉）裂解細(xì)胞。蛋白樣品定量后，于8% SDS-PAGE上進(jìn)行分離，并電轉(zhuǎn)至PVDF膜上，用5%脫脂奶粉溶液進(jìn)行封閉。加入稀釋到合適濃度的GPC3和GAPDH一抗，于4℃孵育過夜進(jìn)行免疫雜交。然后加入HRP標(biāo)記的抗兔二抗，最后加入West Femto化學(xué)發(fā)光檢測底物（PIERCE）進(jìn)行反應(yīng)，顯影檢測。

1.7 細(xì)胞增殖檢測

培養(yǎng)細(xì)胞到匯合度達(dá)80%左右時，按EdU Apollo DNA in vitro Kit（銳博）說明書每孔加入100 μL含50μmol/L EdU培養(yǎng)基孵育2 h；棄培養(yǎng)液，每孔加入100 μL細(xì)胞固定液（含4%多聚甲醛的PBS）室溫孵育15～30 min，再加入2 mg/mL甘氨酸孵育10 min；PBS沖洗，每孔加入100 μL滲透劑（含0.5%TritonX-100的PBS）透化細(xì)胞；加入100 μL的1X Apollo染色反應(yīng)液，避光、室溫孵育30 min；加入100 μL 1X Hoechst 33342反應(yīng)液，避光、室溫孵育10～30 min；洗脫Hoechst33342反應(yīng)液，熒光顯微鏡觀察。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（± s）表示。熒光定量PCR和免疫蛋白印跡檢測實(shí)驗(yàn)采用單因素方差分析（one-way ANOVA）比較各組間差異，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 特異靶向GPC3的siRNA篩選

不同濃度的siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，熒光定量PCR檢測結(jié)果顯示，當(dāng)siRNA GPC3-homo-1633使用量為50 nm時沉默效率最高，為74.87%，而其他濃度和siRNA抑制效果均不超過70%（圖1），因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇GPC3-homo-1633進(jìn)行。

圖1 Real-time PCR檢測靶向GPC3的siRNA的抑制效果

2.2 靶向GPC3的siRNA對GPC3蛋白水平的影響

用Western Blot檢測GPC3-siRNA-1633對GPC3表達(dá)的影響，結(jié)果表明：在Huh7細(xì)胞中GPC3的表達(dá)能明顯被抑制（圖2）。因此，在Huh7細(xì)胞中，GPC3-homo-1633能特異靶向GPC3，導(dǎo)致GPC3轉(zhuǎn)錄翻譯下調(diào)。

圖2 Western Blot檢測siRNA GPC3-homo-1633對GPC3表達(dá)的抑制效果，內(nèi)參為GAPDH

2.3 GPC3表達(dá)下調(diào)會抑制Huh7細(xì)胞增殖

利用特異siRNA下調(diào)GPC3表達(dá)后，發(fā)現(xiàn)EdU陽性的Huh7細(xì)胞顯著減少（圖3），這說明GPC3表達(dá)沉默能抑制Huh7細(xì)胞增殖。

圖3 siRNA下調(diào)GPC3表達(dá)后Huh7細(xì)胞增殖檢測

3 討論

全球原發(fā)性肝癌的發(fā)病率大約占所有腫瘤發(fā)病率的6%，其中有一半以上發(fā)生在中國[4]，且其死亡率在惡性腫瘤中排第3 位[5]。越來越多的研究表明GPC3對于HCC，特別是對于AFP陰性的HCC，可能是一種新的、高靈敏性和特異性的HCC標(biāo)志物[6-9]。

本研究成功篩選出能特異靶向GPC3的siRNA，可以顯著抑制GPC3的轉(zhuǎn)錄翻譯。而當(dāng)GPC3表達(dá)下調(diào)后，發(fā)現(xiàn)Huh7細(xì)胞的增殖受到抑制。因此，可認(rèn)為在HCC中GPC3具有癌基因作用，該基因的表達(dá)能夠促進(jìn)HCC的增殖能力。這與Sun等[10]的研究結(jié)果一致，他們通過轉(zhuǎn)染GPC3特異的siRNA后，也發(fā)現(xiàn)HCC的生長受到抑制，且出現(xiàn)G1期細(xì)胞周期滯留。而Ruan等[11]通過轉(zhuǎn)染靶向GPC3的shRNA表達(dá)載體下調(diào)GPC3表達(dá)后，發(fā)現(xiàn)MHCC97-H細(xì)胞的增殖和侵襲能力均明顯被抑制。

本研究結(jié)果證明GPC3通過影響細(xì)胞的增殖而對HCC的生長起促進(jìn)作用，但GPC3對HCC的影響作用其具體機(jī)制目前還沒有研究清楚，有可能通過多種信號通路起作用。因此，還需要進(jìn)一步研究GPC3在HCC中的具體作用，為HCC的防治提供理論基礎(chǔ)。

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