呂丹青，張朝暉，陳振明

（1.杭州師范大學(xué)生物催化研究室，浙江杭州 311121；2.浙江工業(yè)大學(xué)生物與環(huán)境工程學(xué)院，浙江杭州 310032）

α－羥基酸類物質(zhì)的酶法還原

呂丹青1，2，張朝暉2，陳振明1

（1.杭州師范大學(xué)生物催化研究室，浙江杭州 311121；2.浙江工業(yè)大學(xué)生物與環(huán)境工程學(xué)院，浙江杭州 310032）

手性純α－羥基酸類化合物是合成手性藥物和農(nóng)藥的重要中間體.多種酶催化過程都能用于α－羥基酸類物質(zhì)的合成.酮還原酶是最有應(yīng)用價值的工具酶之一.文章對酮還原酶還原合成α－羥基酸類物質(zhì)進行綜述.

α－羥基酸；酮還原酶；手性合成

α－羥基酸類物質(zhì)是化學(xué)和制藥工業(yè)中的重要手性中間體，其不對稱合成路線的研究得到了很大關(guān)注.用金屬復(fù)合物等純化學(xué)法進行有機合成往往需要強酸、高溫等條件，對環(huán)境不友好，或存在轉(zhuǎn)化率和選擇性低等缺點.酶催化可在水溶液中反應(yīng)，所需條件溫和，環(huán)境和經(jīng)濟問題都能得到有效解決，而且能產(chǎn)生更高化學(xué)、立體和區(qū)域選擇性的產(chǎn)物.近年來，隨著制藥工業(yè)對包括α－羥基酸類物質(zhì)在內(nèi)的手性化合物需求的日益增長和人類環(huán)保意識的增加，酶催化工藝作為一種綠色的手性技術(shù)，已成為化學(xué)制藥領(lǐng)域中研究和應(yīng)用的熱點之一［1］.

多種酶催化過程都能用于α－羥基酸類物質(zhì)的合成.以合成（R）－扁桃酸為例，可采用酶法拆分、不對稱轉(zhuǎn)化和手性還原等方法［2］.酮還原酶作為一種工具酶，已經(jīng)在很多手性醇的工業(yè)合成中得到了應(yīng)用［3］.文章擬對利用酮還原酶還原合成α－羥基酸類物質(zhì)進行綜述.

1 酮還原酶的來源

一個方便易用的酶庫及相應(yīng)的高效篩選方法是生物催化得以大規(guī)模工業(yè)化應(yīng)用的前提條件之一.Saccharomycescerevisiae［4］，Candidamagnoliae（酵母）［5］，Thermoanaerobactorbrockii（厭氧細菌）［6］，Geotrichumcandidum（真菌）［7］，放線菌［8］以及多種植物（胡蘿卜、馬鈴薯、甘薯等）［9］和紅藻［10］、小球藻［11］中都已經(jīng)發(fā)現(xiàn)有酮還原酶能用于手性羥基酸類物質(zhì)的制備.

由于熱穩(wěn)定性是衡量生物催化劑的關(guān)鍵指標，嗜熱微生物將成為酮還原酶的重要來源.

1.1 產(chǎn)酶微生物的篩選和酶基因的克隆表達

利用傳統(tǒng)的方法進行微生物篩選仍是得到酮還原酶的主要途徑之一.例如，通過對191種細菌、59種放線菌、230種酵母、81種霉菌和42種擔(dān)子菌的篩選，得到三株菌（Rhodotorulaminuta、Candidaparapsilosis和Aspergillusniger）能高選擇性地不對稱還原二氫－4，4－二甲基－2，3－呋喃二酮，生成D－（—）－泛酰內(nèi)酯［12－13］.Candidaparapsilosis可以不對稱還原產(chǎn)生S型的β，γ－不飽和/飽和α－羥基酯（圖1），反應(yīng)具有高選擇性（ee值為93%～99%）和高產(chǎn)率（58%～71%）［14］.

圖1 Candidaparapsilosis對α－酮酸類物質(zhì)的手性還原Fig.1 The asymmetric reductions ofα－h(huán)ydroxy acids by Candidaparapsilosis

1.2 Genome mining

隨著基因組信息的指數(shù)增長，數(shù)據(jù)庫挖掘正成為生物催化劑的一個重要來源，即通過研究比較在線數(shù)據(jù)庫的信息發(fā)現(xiàn)新酶，包括基因信息（核酸序列為基礎(chǔ)）和酶（通常根據(jù)測到的活性分析）.原先，遺傳信息和酶活性多為獨立收集的，但現(xiàn)在的資源都是綜合交叉的.蛋白（酶）和核酸序列間的信息關(guān)聯(lián)，說明生物信息學(xué)（應(yīng)用數(shù)學(xué)和計算機技術(shù)進行序列信息分析）的日益重要.

R.Machielsen［15］根據(jù)3條已發(fā)現(xiàn)的Pyrococcusfuriosus來源的酮還原酶，分析P.furiosus的基因組，從中找到了16條可能表達酮還原酶的基因.其中AdhD在E.coli中表達，研究其酶學(xué)性質(zhì)，發(fā)現(xiàn)AdhD具熱穩(wěn)定性（活性隨溫度升高而增強，100℃下半衰期為130min），具廣譜底物活性，能選擇性還原包括α－酮酯在內(nèi)的多種酮類物質(zhì)［16］.

1.3 宏基因組研究

環(huán)境樣品中不到1%的微生物能利用傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)技術(shù)實現(xiàn)純培養(yǎng).隨著分子生物學(xué)技術(shù)的進步，各種高通量篩選方法的建立，宏基因組研究逐漸成為新酶發(fā)現(xiàn)的重要工具.

在構(gòu)建宏基因組DNA文庫的基礎(chǔ)上進行篩選可比較容易地篩選到新酶.如在一個以篩選能催化短鏈多元醇氧化形成羰基的氧化還原酶為目的的研究中［17］，以3種土樣（草地、甜菜場、農(nóng)田）的宏基因組建立文庫，得到約1 267 000個克?。―NA大小約為4.05Gbp），篩選得到6個克隆能催化形成羰基，也能還原二羥基丙酮、乙醇醛、丙酮醛等羰基.但是，可用于酮酸類化合物還原的酶還沒有文獻報道.

2 酶催化反應(yīng)的進一步優(yōu)化

在篩選獲得適于催化反應(yīng)的某個酶后，往往還需要進一步改造.改造可從催化劑本身、反應(yīng)底物和反應(yīng)環(huán)境等方面來考慮.

2.1 酶改造

通過突變改進酶性能主要有兩種策略［18］：1）理性突變，如點突變和定點飽和突變；2）隨機突變，如定向進化（模擬自然進化過程，隨機改變氨基酸，構(gòu)建酶庫，從中選擇所需蛋白）.當(dāng)酶的結(jié)構(gòu)未知或無法預(yù)測，隨機突變是唯一的選擇.

Candidatenuis來源的木糖還原酶對多種芳香族α－酮酯具選擇性還原能力，ee值大于99%，但是活性較低.為了提高活性，將其23位的Trp突變?yōu)镻he和Tyr，得到突變體W23F和W23Y.檢測顯示突變體具有比野生型高8倍的還原能力，同時選擇性和ee值不變［19］.

Bacillusstearothermophillus來源的乳酸脫氫酶（bsLDH）對α－酮酸類物質(zhì)有手性還原能力，在存在激活劑果糖－1－6－二磷酸（FBP）時其Km為0.05mM，而無FBP時Km為5mM.FBP價格昂貴，難以放大工藝.定向進化bsLDH，經(jīng)過三輪隨機突變后得到一突變體6A，其在無FBP的條件下Km為0.07mM.分析發(fā)現(xiàn)，6A有3個非活性位點的突變（R118C，Q203L和N307S），這三點突變使酶對底物的親和力大大增強，擺脫酶對激活劑的依賴［20］.

另外，由于NADH價格相比NADPH更為便宜，可將NADPH依賴的酮還原酶經(jīng)點突變改造成對NADH依賴，使反應(yīng)更經(jīng)濟［21］.

2.2 酶固定化

酶的固定化是改進酶的可操作性和回收利用的最有效的方法之一.Yunling Bai等［22］將D－乳酸脫氫酶（LDH）與Candidaboidinii細胞同時固定于聚乙烯亞胺，手性還原2－氧代－4－苯基丁酸（OPBA）生成R－2－羥基－4－苯基丁酸（R－HPBA）.反應(yīng)中由C.boidinii細胞內(nèi)的甲酸脫氫酶提供NADH循環(huán)，比游離甲酸脫氫酶更穩(wěn)定，制備更方便.R－HPBA的時空產(chǎn)率可達到9g/L·h，產(chǎn)物產(chǎn)率有0.95mol/mol OPBA.

2.3 介質(zhì)工程

生物催化劑能在多種介質(zhì)中催化反應(yīng).非水介質(zhì)（CO2、離子流等）能控制選擇性，也能改進反應(yīng)體系的環(huán)境友好程度.在某些情況下，有機溶劑也能改變反應(yīng)的立體選擇性.如圖2所示，面包酵母在水相中還原2－氧代己酸乙酯，能得到相應(yīng)的R－和S－醇產(chǎn)物，由于R－產(chǎn)物的進一步不對稱分解，最后得到的主要產(chǎn)物是S－產(chǎn)物.但是，當(dāng)反應(yīng)體系為苯時，底物高產(chǎn)地被還原為R－產(chǎn)物.這是因為底物在苯層中溶解良好，使得酶周圍水層中的有效底物濃度降低了.所以，當(dāng)細胞中有多種酶具有重疊的底物特異性，但卻是不同的選擇性時，就可以通過改變底物濃度來選擇由哪種酶催化反應(yīng)，因為酶反應(yīng)遵循米氏方程：具有低Km的酶選擇催化低濃度的底物，反之高Km、高Vmax的酶催化高濃度的底物［23］.

圖2 面包酵母在水相和苯中的還原反應(yīng)Fig.2 The asymmetric reduction of ketones by baker's yeast in water and in benzene

2.4 底物修飾

一個生物催化還原反應(yīng)的選擇性可以通過改變底物而改變，因為還原反應(yīng)很大程度上受到底物結(jié)構(gòu)的影響.以面包酵母還原4－氯乙酰乙酸酯為例，酯基的長度決定了還原反應(yīng)的選擇性.當(dāng)?shù)孜锏孽セ∮诙』鶗r得到的是S型底物，大于戊基時得到的是R型產(chǎn)物.所以只要在還原反應(yīng)后對酯基進行改造，就可以得到任何一種手性的4－氯乙酰乙酸酯［24－26］.

3 酮還原酶在α－羥基酸類物質(zhì)合成中的應(yīng)用

近年來，隨著對酮還原酶多功能催化作用的深入研究，已開發(fā)了多種α－羥基酸類物質(zhì)的酶法合成工藝.

R－鄰氯扁桃酸甲酯是合成血小板凝集抑制劑氯吡格雷的重要中間體，Tadashi Ema等［27］將Saccharomycescerevisiae來源的羰基還原酶SCR和葡萄糖脫氫酶在E.coli中共表達構(gòu)建重組菌，還原產(chǎn)生R－鄰氯扁桃酸甲酯.20℃，2g底物（1.0M）得到產(chǎn)物質(zhì)量濃度高達178g/L，ee＞99%.此工藝易放大，100mL反應(yīng)體系中含20g底物，20℃反應(yīng)24h能得到15g手性純R－鄰氯扁桃酸甲酯.

紫杉酚（taxol）是抗有絲分裂抑制劑，是治療癌癥的有效、常用藥物.其合成過程中的一個關(guān)鍵前體是手性C13側(cè)鏈紫杉醇.可用酵母Hansenulapolymorpha和Hansenulafabianii對酮酯a進行選擇性還原（圖3）［28］，其產(chǎn)率都大于80%（ee＞94%）.H.polymorpha催化得到20%的非對映體產(chǎn)物，而H.fabianii的是10%.但是H.polymorpha催化的ee有99%，而H.fabianii的是94%.已用H.fabianii建立了15L級的單級發(fā)酵/生物還原工藝.

圖3 酵母催化生成手性C13側(cè)鏈紫杉酚Fig.3 Enzymatic synthesis of chiral C－13side－chain paclitaxel by yeast

4 結(jié) 論

酶制劑是生物技術(shù)領(lǐng)域最重要的產(chǎn)品之一，在制藥、農(nóng)業(yè)、食品等產(chǎn)業(yè)中的應(yīng)用廣泛.隨著基因組信息的指數(shù)增長，生物催化的應(yīng)用潛力正在迅速實現(xiàn).手性α－羥基酸類化合物是化學(xué)和制藥業(yè)中重要的結(jié)構(gòu)單位，利用酮還原酶合成這類化合物的研究已成為近幾年來生物催化領(lǐng)域一個備受矚目的焦點.

［1］盧小春，賴敦岳，裴曾飛，等.α－苯乙醇的酶法拆分工藝優(yōu)化［J］.杭州師范大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版，2010，9（4）：252－256.

［2］Gr?ger H.Enzymatic routes to enantiomerically pure aromatic alpha－h(huán)ydroxy carboxylic acids：A further example for the diversity of biocatalysis［J］.Adv Synth Catal，2001，343：547－558.

［3］Chen Zhenming，Tao Junhua（Alex）.Emerging enzymes and their synthetic applications［M］//Tao Junhua（Alex），Kazlauskas R.Biocatalysis for Green Chemistry and Chemical Process Development.New York：John Wiley ＆Sons，Inc，2011：45－65.

［4］Jung J，Park H J，Uhm K，etal.Asymmetric synthesis of（S）－ethyl－4－chloro－3－h(huán)ydroxy butanoate using aSaccharomycescerevisiaereductase：Enantioselectivity and enzyme－substrate docking studies［J］.Biochimica et Biophysica Acta，2010，1804（9）：1841－1849.

［5］Wada M，Kataoka M，Kawabata H，etal.Purification and characterization of NADPH－dependent carbonyl reductase，involved in stereoselective reduction of Ethyl 4－Chloro－3－oxobutanoate，fromCandidamagnolia［J］.Biotechnol Biochem，1998，62（2）：280－285.

［6］Sonnleitner B，F(xiàn)iechter A.Application of immobilized cells ofThermoanaerobiumbrockiifor stereoselective reductions of oxo－acid esters［J］.Appl Microbiol Biotechnol，1986，23（6）：424－429.

［7］Chen Yongzheng，Xu Jinggang，Xu Xiaoyng，etal.Enantiocomplementary preparation of（S）－and（R）－mandelic acid derivatives viaαhydroxylation of 2－arylacetic acid derivatives and reduction ofα－ketoester using microbial whole cells［J］.Tetrahedron：Asymmetry，2007，18（21）：2537－2540.

［8］Ishihara K，Yamaguchi H，Omori T，etal.A novel zinc－containingα－keto ester reductase from actinomycete：an approach based on protein chemistry and bioinformatics［J］.Biotechnol Biochem，2004，68（10）：2120－2127.

［9］Utsukihara T，Watanabe S，Tomiyama A，etal.Stereoselective reduction of ketones by various vegetables［J］.Journal of Molecular Catalysis B：Enzymatic，2006，41（3/4）：103－109.

［10］Utsukihara T，Misumi O，Kato N，etal.Reduction of various ketones by red algae［J］.Tetrahedron：Asymmetry，2006，37（44）：1179－1185.

［11］Ishihara K，Iwai R，Yoshida M，etal.Purification and characterization of a novel keto ester reductase from the green alga，Chlorella sorokiniana：comparison of enzymological properties with other microbial keto ester reductases［J］.World Journal of Microbiol Biotechnol，2011，27（1）：17－24.

［12］Shimizu S，Hata H，Yamada H.Reduction of ketopantoyl lactone to D－（—）－pantoyl lactone by microorganisms［J］.Agric Biol Chem，1984，48：2285－2291.

［13］Kataoka M，Shimizu S，Doi Y，etal.Microbial production of chiral pantothenonitrile through stereospecific reduction of 2′－ketopantothenonitrile［J］.Biotechnol Letters，1990，12：357－360.

［14］Baskar B，Pandian N G，Priya K，etal.Asymmetric reduction of alkyl 2－oxo－4－arylbutanoates and－but－3－enoates byCandida parapsilosisATCC7330：assignment of the absolute configuration of ethyl 2－h(huán)ydroxy－4－（p－methylphenyl）but－3－enoate by1H NMR［J］.Tetrahedron：Asymmetry，2004，15（24）：3961－3966.

［15］Machielsen R，Uria A，Kengen S，etal.Production and characterization of a thermostable alcohol dehydrogenase that belongs to the aldo－keto reductase superfamily［J］.Applied and Environmental Microbiology，2006，72（1）：233－238.

［16］Zhu Dunming，Malik H，Hua Ling.Asymmetric ketone reduction by a hyperthermophilic alcohol dehydrogenase.The substrate specificity，enantioselectivity and tolerance of organic solvents［J］.Asymmetry，2006，17（21）：3010－3014.

［17］Knietsch A，Waschkowitz T，Bowien S，etal.Construction and screening of metagenomic libraries derived from enrichment cultures：generation of a gene bank for genes conferring alcohol oxidoreductase activity onEscherichiacoli［J］.Applied and Environmental Microbiology，2003，69（3）：1408－1416.

［18］Chen R.Enzyme engineering：rational redesign vs.directed evolution［J］.Trends in Biotechnology，2001，19（1）：13－14.

［19］Kratzer R，Nidetzky B.Identification ofCandidatenuisxylose reductase as highly selective biocatalyst for the synthesis of aromatic alpha－h(huán)ydroxy esters and improvement of its efficiency by protein engineering［J］.Chem Commun，2007（10）：1047－1049.

［20］Allen S，Holbrook J.Production of an activated form ofBacillusstearothermophilusL－2－h(huán)ydroxyacid dehydrogenase by directed evolution［J］.Protein Engineering，2000，13（1）：5－7.

［21］Morikawa S，Nakai T，Yasohara Y，etal.Highly active mutants of carbonyl reductase S1with inverted coenzyme specificity and production of optically active alcohols［J］.Biotechnol Biochem，2005，69（3）：544－552.

［22］Bai Yunling，Yang Shangtian.Biotransformation of R－2－h(huán)ydroxy－4－phenylbutyric acid by D－lactate dehydrogenase andCandidaboidiniicells containing formate dehydrogenase coimmobilized in a fibrous bed bioreactor［J］.Biotechnol and Bioengineering，2005，92（2）：137－146.

［23］Nakamura K，Yamanaka R，Matsuda T，etal.Recent developments in asymmetric reduction of ketones with biocatalysts［J］.Tetrahedron：Asymmetry，2003，14（18）：2659－2681.

［24］Zhou Bingnan，Gopalan A，VanMiddlesworth F，etal.Stereochemical control of yeast reductions.1.Asymmetric synthesis of L－carnitine［J］.J Am Chem Soc，1983，105（18）：5925－5926.

［25］Chen C，Zhou Bingnan，Girdaukas G，etal.Stereochemical control of yeast reductions.2.Quantitative treatment of the kinetics of competing enzyme systems for a single substrate［J］.Bioorg Chem，1984，12（2）：98－117.

［26］Shieh W，Gopalan A，Sih C.Stereochemical control of yeast reductions.5.Characterization of the oxidoreductases involved in the reduction of beta.－keto esters［J］.J Am Chem Soc，1985，107（10）：2993－2994.

［27］Ema T，Ide S，Okita N，etal.Highly efficient chemoenzymatic synthesis of methyl（R）－o－chloromandelate，a key intermediate for clopidogrel，viaasymmetric reduction with RecombinantEscherichiacoli［J］.Advanced Synthesis ＆Catalysis，2008，350（13）：2039－2044.

［28］Patel R，Banerjee A，Howell J，etal.Stereoselective microbial reduction of 2－keto－3－（N－benzoylamino）－3－phenyl propionic acid ethyl ester［J］.Annals of the New York Academy of Sciences，1995，750（1）：166－174.

Enzymatic Reduction ofα－Hydroxy Acids

LüDan－qing，ZHANG Zhao－h(huán)ui，CHEN Zhen－ming

（1.Lab of Biocatalysis，Hangzhou Normal University，Hangzhou 311121，China；
2.College of Biological ＆Environmental Engeering，Zhejiang University of Technology，Hangzhou 310032，China）

Chiralα－h(huán)ydroxy acids are important intermediate for the synthesis of drugs and pesticides.Various enzymatic processes can be used into the synthesis ofα－h(huán)ydroxy acids.Ketoreductase is the most useful enzymes.This paper summarized the synthesis ofα－h(huán)ydroxy acids by ketoreductase.

α－h(huán)ydroxy acids；ketoreductase；chiral synthesis

Q814.9

A

1674－232X（2012）01－0033－05

11.3969/j.issn.1674－232X.2012.01.007

2011－03－22

陳振明（1971—），男，副教授，主要從事生物催化和綠色化學(xué)研究.E－mail：zmchen05＠gmail.com