天津醫(yī)科大學總醫(yī)院 徐蕭洪，宋作慶，李世彬

山東省千佛山醫(yī)院 劉振3

瀘州醫(yī)學院 王文軍5

肺癌是全球范圍內(nèi)最常見的惡性腫瘤之一， 80%以上的腫瘤患者死于腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移。有研究顯示，結締組織生長因子(connective tissue growth factor, CTGF)可能在腫瘤生長和血管生成中起作用。腫瘤血管的生成為腫瘤的生長提供了充足的營養(yǎng)，加速了腫瘤的生長，而且為腫瘤細胞進入血液循環(huán)創(chuàng)造了極為有利的條件，成為促進腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的重要因素。本課題組采用免疫組織化學的方法檢測了CTGF在非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)中的表達情況，并研究了CTGF表達與NSCLC臨床病理特征之間的關系及意義。CTGF作為抑制腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的途徑之一，為防治腫瘤轉(zhuǎn)移提供了一個很有前途的新靶點。檢測NSCLC患者CTGF的表達，對于手術治療的范圍的選擇將具有參考價值，以減少不必要的擴大手術，減少患者的器官功能缺損，提高生活質(zhì)量；監(jiān)測術后CTGF的表達水平，將有望成為判斷患者的復發(fā)、預后的一個新的指標。

1 資料與方法

1.1 研究對象 標本選自瀘州醫(yī)學院附屬醫(yī)院胸外科2006年1月—2007年2月收治的肺癌患者手術后存檔石蠟標本，50例患者均有完整的病理資料。所有患者術前均未接受放療及化療，術后均經(jīng)組織病理學確診，并取10例正常肺組織作為對照。

1.2 腫瘤患者資料 NSCLC患者50例，其中男性36例，女性14例；年齡13～76歲，平均年齡59.6歲；按UICC(1997年)制定的分期標準進行術后病理分期，I期12例，Ⅱ期13例，Ⅲ期20例，Ⅳ期5例。根據(jù)WHO標準分型，肺鱗癌20例，肺腺癌18例，混合癌(大細胞＋腺鱗癌)12例；其中伴淋巴結轉(zhuǎn)移者35例，不伴淋巴結轉(zhuǎn)移者15例；高分化癌13例，中分化癌20例，低分化癌17例。

1.3 檢測方法及結果判定 采用免疫組織化學法(S-P法)，以PBS代替一抗作陰性對照。陽性結果判定：CTGF和TGF-β1蛋白表達主要在細胞質(zhì)中，以棕黃色顆粒為陽性，不著色為陰性。判定標準：切片中陽性細胞率及染色反應強度作為分級標準。即陰性(-)為細胞質(zhì)不著色或陽性細胞率＜10%；弱陽性(+)為細胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)淺棕黃色顆粒和(或)陽性細胞率為10%～25%；陽性(++)為細胞漿內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒和(或)陽性細胞率為26%～50%；強陽性(+++)為細胞漿內(nèi)出現(xiàn)深棕黃色顆粒和(或)陽性細胞率＞51%。以PBS代替一抗作為陰性對照。

1.4 統(tǒng)計處理 采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析，四表格資料用Fish精確概率法、χ2檢驗法分析CTGF表達與臨床病理指標的關系；等級資料的兩樣本比較用秩和檢驗，雙變量資料的等級相關性用Spearman等級相關分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 CTGF在NSCLC和正常肺組織中的表達情況的比較 CTGF主要定位于正常細胞的細胞質(zhì)中，在NSCLC組織中的陽性表達率為32%(16/50)，10例正常肺組織中有9例CTGF呈陽性表達，二者差異有統(tǒng)計學意義(圖1，P=0.001，χ2=11.534)。

2.2 CTGF表達與NSCLC臨床病理特征的關系 CTGF在NSCLC組織中的陽性表達率為30%,CTGF表達水平與NSCLC患者性別、原發(fā)腫瘤大小、組織學類型、癌細胞分化程度均無相關性(P＞0.05)；而與臨床分期及淋巴結轉(zhuǎn)移有關 (P值分別為0.002和0.001)。在T N M分期中，其陽性表達率分別為Ⅰ～Ⅱ期(50%)；Ⅲ～Ⅳ期(9.09%)。Ⅰ～Ⅱ期與Ⅲ～Ⅳ期比較差異有統(tǒng)計意義。術后證實有淋巴結轉(zhuǎn)移組中CTGF的陽性表達率為17.14%，淋巴結無轉(zhuǎn)移組中CTGF的陽性表達率為66.67%，兩組相比差異具有顯著的統(tǒng)計學意義(P＜0.005)。(表1)

圖1 CTGF在正常肺組織和癌組織中的表達情況

3 討論

表1 CTGF表達與NSCLC臨床病理因素的關系Table 1 Relationship between the expression of CTGF and the different clinicopathologic factors in NSCLC

目前肺癌是全球范圍內(nèi)最常見的惡性腫瘤之一，高發(fā)病率和低存活率使得肺癌成為腫瘤的主要死因。因此對肺癌的侵襲和轉(zhuǎn)移的機理研究變得尤為重要。

CTGF是從人臍靜脈內(nèi)皮細胞cDNA文庫中首次克隆到的，屬生長因子CCN基因家族的亞家族成員。CTGF可以分泌細胞外基質(zhì)聯(lián)合蛋白，調(diào)節(jié)細胞生長過程，具有明顯的有絲分裂原性和趨化性。近年有研究表明，CTGF表達與惡性腫瘤發(fā)生、進展、細胞外基質(zhì)形成、轉(zhuǎn)移及預后密切相關，腫瘤細胞自分泌的CTGF與相應受體或配體結合后能抑制腫瘤細胞生長、誘導細胞外基質(zhì)形成及抑制轉(zhuǎn)移的發(fā)生。

本研究中發(fā)現(xiàn)，CTGF在NSCLC中為低表達，50例NSCLC標本中CTGF表達減弱，陽性率僅為30%，低于正常肺組織的70%。免疫學證實，其在正常的細支氣管上皮組織中大量表達，而在腫瘤細胞卻未見表達。這與以往報道[1]，CTGF在正常的乳腺上皮細胞內(nèi)皮細胞和基質(zhì)細胞呈高表達，而很少在乳腺癌細胞中表達的結果一致。

本研究結果顯示，CTGF的表達率在有淋巴結轉(zhuǎn)移者中顯著低于無淋巴結轉(zhuǎn)移者，在臨床Ⅲ-Ⅳ期NSCLC患者中顯著低于Ⅰ-Ⅱ期患者。而CTGF表達水平與NSCLC患者性別、原發(fā)腫瘤大小、組織學類型及癌細胞的分化程度均無相關性，所以CTGF表達水平的降低具有提示腫瘤轉(zhuǎn)移的意義。如果能闡明CTGF在肺癌發(fā)展過程中的作用機制，可能會為肺癌的治療尋找新的治療靶點提供科學依據(jù)。筆者認為CTGF在肺癌中抑制腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的作用機制可能有以下原因：(1)內(nèi)皮細胞生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是調(diào)節(jié)腫瘤伴隨血管生成的主要細胞調(diào)節(jié)因子，可以促進腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移。有研究顯示，CTGF可以和VEGF165相互作用形成復合物[2]，從而使CTGF抑制VEGF誘導的血管生成[3]，隨后進一步抑制NSCLC血管的生成和轉(zhuǎn)移。有實驗證明CTGF對VEGF-A基因表達的影響是通過ARD-1 (arrestdefective 1)依賴的乙?；铀貶IF-1α蛋白降解介導的[4]。由此可以說CTGF是一個血管生成的抑制劑，抑制肺腺癌的血管生成和轉(zhuǎn)移。(2)過表達的CTGF在誘導細胞周期停滯在G0/G1期的同時伴隨對p53h和p14 [ADP ribosylation factor (ARF)]的誘導。ARF可以調(diào)節(jié)p53的水平，對抗MDM2并保護p53不被降解[5,6]。在成纖維細胞中，ARF是通過p53誘導細胞周期停滯在G1和G2期。ARF在NSCLC中經(jīng)常被滅活或不表達[7-9]。本結果表明，CTGF的表達可以增加ARF的表達水平, ARF不能通過DNA損傷劑激活。未調(diào)節(jié)的E2F1活性能誘導ARF蛋白表達，并依次穩(wěn)定p53，導致細胞周期停滯及防止不受控制的細胞增殖。

已知C T G F蛋白包含一個胰島素樣生長因子(insulin-like growth factor，IGF)結合蛋白區(qū)域。IGF-I依賴的Akt磷酸化和EGF依賴的ERK1/2磷酸化可以被CTGF過量表達而抑制[10]。以往的研究表明，在乳腺癌中WISP3(CCN6)可以調(diào)節(jié)IGF-I受體信號通過和IGF-1的相互作用[11]。相同的理論對于CTGF，盡管研究證明CTGF對IFG-1有相對低的親和力。Akt和p53通路形成一個反饋回路，Akt活化導致MDM2磷酸化，最終引起p53的滅活，反之，p53的活化也可以抑制Akt的作用[12]。CTGF的表達可以影響p53通路的這種相互干擾，同時抑制Akt通路。這些細胞的生長停滯可能是由CTGF通過E2F1和ARF誘導p53表達引起的。研究發(fā)現(xiàn)，CTGF可以通過一種CRMP-1依賴的基質(zhì)抑制肺癌的轉(zhuǎn)移和侵襲，CTGF是通過調(diào)節(jié)整合素偶聯(lián)小G蛋白，從而影響CRMP-1的表達[13]。整合素是CCN蛋白家族的重要受體，并且受體激活作用可以產(chǎn)生多種。CTGF蛋白可以直接和整合素αvβ3和αⅡbβ3作用。CTGF和整合素αvβ3的相互作用能促進上皮細胞發(fā)生黏附和轉(zhuǎn)移，并誘導新生血管的生成。CTGF也可以通過整合α6β1促進人皮膚成纖維細胞轉(zhuǎn)移和增殖[14]。相反的，整合素αvβ3和αvβ5可能只針對CTGF介導的侵襲抑制。

綜上所述，CTGF在肺癌組織中呈低表達，而在正常組織中高表達，其可能與肺癌的分期和轉(zhuǎn)移有關。由于NSCLC的發(fā)生、發(fā)展很可能受多種機制的控制，且CTGF可能通過不同的機制參與了腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。因此CTGF在肺癌中的真正機制仍需進一步研究。

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