梁瑞韻， 伍 衛(wèi)， 黃 瑾， 江山平， 黃林潔， 李依群

(1中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院呼吸內(nèi)科，廣東 廣州510120;中山大學(xué)附屬第五醫(yī)院2心內(nèi)科，3呼吸內(nèi)科，廣東 珠海519000)

支氣管哮喘(哮喘)是一種免疫失衡性疾病，既往觀(guān)點(diǎn)認(rèn)為T(mén)h1/Th2 失衡在哮喘的發(fā)病機(jī)制中扮演著重要角色。但近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)CD4+T 細(xì)胞的其中一個(gè)亞群具有調(diào)節(jié)功能并參與哮喘的免疫調(diào)節(jié)，其中，CD4+CD25+T 細(xì)胞的作用受到很大的關(guān)注。尤其是CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞(regulatory T cells，Treg)紊亂導(dǎo)致的免疫耐受破壞在哮喘的發(fā)病機(jī)制中起著重要作用。CD4+CD25+T 細(xì)胞在哮喘發(fā)病中的作用引起了人們的廣泛關(guān)注，其作為一群調(diào)節(jié)機(jī)體免疫應(yīng)答的重要細(xì)胞，本身也應(yīng)存在一個(gè)被調(diào)節(jié)的過(guò)程，在人體微環(huán)境改變的情況下，CD4+CD25+T 細(xì)胞能否被調(diào)控呢?

眾所周知，鎂能緩解氣道平滑肌痙攣，使支氣管擴(kuò)張。由于其有效、使用安全、副作用少，鎂劑在哮喘的應(yīng)用已得到廣泛推廣。而鎂能否調(diào)節(jié)CD4+CD25+T 細(xì)胞的凋亡情況及其特殊的轉(zhuǎn)錄因子叉頭框蛋白3(forkhead box protein 3，F(xiàn)oxp3)的表達(dá)，目前未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)擬通過(guò)分離純化并培養(yǎng)健康人及哮喘患者外周血中CD4+CD25+T 細(xì)胞，以鎂劑干預(yù)后，再檢測(cè)CD4+CD25+T 細(xì)胞的凋亡情況及其Foxp3的表達(dá)情況，了解鎂對(duì)哮喘患者CD4+CD25+T 細(xì)胞的影響，以更深入地了解支氣管哮喘的發(fā)病機(jī)制，從而為支氣管哮喘的防治提供新的思路。

材 料 和 方 法

1 研究對(duì)象

健康成年人16 人，平均年齡(25 ±13)歲，男6 名，女10名，為本院健康志愿者。哮喘患者16 人，平均年齡(33 ±12)歲，男10 名，女6 名，符合《支氣管哮喘防治指南》診斷標(biāo)準(zhǔn)，為本院門(mén)診及住院病人，均未使用鎂劑或影響鎂排泄的藥物(如利尿劑)2 周以上，未使用糖皮質(zhì)激素類(lèi)藥物或停用1 周以上;其中8 例為支氣管哮喘急性發(fā)作患者。

2 主要試劑和儀器

完全培養(yǎng)基包括RPMI－1640(Gibco)、10% 小牛血清(杭州四季清公司)、2 mmol/L L－谷氨酰胺、10 mmol/L HEPES、1 ×105U/L 青霉素和100 mg/L 鏈霉素;淋巴細(xì)胞分離液(1 073 g/L，上海恒信化學(xué)試劑有限公司);注射用硫酸鎂(2.5 g∶10 mL，廣州化學(xué)試劑廠(chǎng)，批號(hào)070402);碘化丙啶(propidium iodide，PI;Sigma);核糖核酸酶A(RNaIse A，25 mg;Sigma);鼠抗人IgG1－FITC/IgG1－PE (Becton Dickinson);CD25－FITC/CD4－PE (Becton Dickinson);鼠抗人CD8純化抗體(Becton Dickinson);Phycoerythrin－Cy5(PE－Cy5);抗人Foxp3 抗體(eBioscience);羊抗鼠IgG 免疫磁珠(goat anti－mouse IgG immunomagnetic beads，晶美生物工程有限公司);FACSCalibur 型流式細(xì)胞儀(Becton Dickinson);HERAcell CO2培養(yǎng)箱(Heraeus)。

3 方法

3.1 健康人及哮喘患者外周血CD4+CD25+T 細(xì)胞的分離及培養(yǎng) 按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，具體如下:(1)所有受試者無(wú)菌取外周靜脈血15 mL，分離、洗滌外周血單核細(xì)胞，并分離出T 淋巴細(xì)胞。(2)按2 μg∶107cells 加入鼠抗人CD8 純化抗體，反應(yīng)后離心棄上清中未結(jié)合的抗體，按60 μg∶107cells 加入羊抗鼠IgG 免疫磁珠，反應(yīng)后加入RPMI－1640 完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，磁分離器分離，收集未被免疫磁珠結(jié)合的細(xì)胞懸液(即CD4+T 細(xì)胞)至另一干凈管中。(3)按2 μg∶107cells 加入鼠抗人CD25 純化抗體，反應(yīng)、離心后棄上清中未結(jié)合的抗體，按60 μg∶107cells 加入羊抗鼠IgG 免疫磁珠，反應(yīng)后加入RPMI－1640 完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，磁分離器分離，收集被免疫磁珠結(jié)合的細(xì)胞懸液(即CD4+CD25+T 淋巴細(xì)胞)至另一干凈管中。(4)用24 孔板培養(yǎng)，分空白組和鎂劑干預(yù)組(鎂離子終濃度為10 mmol/L)，以RPMI－1640 完全培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞終濃度，使每孔5 ×105cells∶1.5 mL，置37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h，收集0 和72 h 細(xì)胞進(jìn)行相關(guān)檢測(cè)。

3.2 外周血CD4+CD25+T 細(xì)胞純度的檢測(cè) (1)取100 μL CD4+CD25+T 細(xì)胞懸液，洗滌后在各測(cè)定管中加入CD25－FITC/CD4－PE 各20 μL，向陰性對(duì)照管中加入小鼠IgG1－FITC/IgG1－PE 單抗各20 μL，避光孵育并離心2 次。(2)于流式細(xì)胞儀(CellQuest 程序)中檢測(cè)10 000 個(gè)細(xì)胞，于FSC－SSC點(diǎn)圖設(shè)矩形門(mén)R1 排除碎屑，再作IgG1－FITC/IgG1－PE 點(diǎn)圖，設(shè)陰性對(duì)照十字門(mén)使包括左下象限95%細(xì)胞，將陰性對(duì)照?qǐng)D中的十字門(mén)復(fù)制、粘貼于CD25－FITC/CD4－PE 點(diǎn)圖中，統(tǒng)計(jì)分析CD4+CD25+T 細(xì)胞陽(yáng)性率。

3.3 CD4+CD25+T 細(xì)胞占CD4+T 細(xì)胞的比例檢測(cè) (1)取100 μL CD4+T 細(xì)胞懸液(1 ×105細(xì)胞)加入抗CD4－PE/CD25－FITC 單抗各20 μL，避光孵育。(2)向陰性對(duì)照管中加入小鼠IgG1－FITC/IgG1－PE 單抗各20 μL，避光孵育。(3)調(diào)整細(xì)胞濃度，于流式細(xì)胞儀(CellQuest 程序)中檢測(cè)，統(tǒng)計(jì)分析CD4+CD25+T 細(xì)胞陽(yáng)性率。

3.4 DNA 含量分布的流式細(xì)胞儀檢測(cè) (1)收集細(xì)胞并離心，70%乙醇500 μL 4 ℃固定24 h 以上，以PBS 洗滌后離心2 次，加入5 g/L RNase A 10 μL，室溫避光反應(yīng)后加入10 mg/L PI 染液10 μL，4 ℃避光染色。(2)調(diào)整細(xì)胞濃度，以488 nm 激發(fā)波長(zhǎng)，于流式細(xì)胞儀(CellQuest 程序)中檢測(cè)細(xì)胞，于FSC－SSC 點(diǎn)圖設(shè)矩形門(mén)R1 排除碎屑，再作FL2W－FL2A 點(diǎn)圖及FL2A－counts 直方圖，統(tǒng)計(jì)亞二倍體峰比例變化。

3.5 Foxp3 在CD4+CD25+T 細(xì)胞表達(dá)強(qiáng)度的流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè) (1)分離外周血CD4+CD25+T 細(xì)胞后，調(diào)整細(xì)胞濃度為1 ×109/L，取100 μL 細(xì)胞懸液(1 ×105細(xì)胞)加入新配制的固定/透膜液1 mL，4 ℃避光反應(yīng)60 min，洗滌2 次，離心后棄上清。(2)加入PE－Cy5 標(biāo)記抗人Foxp3 抗體20 μL，4 ℃避光孵育30 min，洗滌后離心棄上清。(3)調(diào)整細(xì)胞濃度，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)，于FSC－SSC 點(diǎn)圖設(shè)矩形門(mén)R1 排除碎屑，做Foxp3 直方圖并記錄其均值，CellQuest 軟件獲取并分析數(shù)據(jù)。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 13.0 軟件進(jìn)行獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn)。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 外周血CD4 +CD25 +T 細(xì)胞的純度檢測(cè)

健康人外周血CD4+CD25+T 細(xì)胞的純度為77.4% ～92.3%，哮喘患者CD4+CD25+T 細(xì)胞的純度為75.2% ～93.8%，見(jiàn)圖1。

Figure 1. Purity of CD4 +CD25 +T cells detected by flow cytometry. A，B:heath group;C，D:asthma group.圖1 外周血CD4 +CD25 +T 細(xì)胞純度的流式細(xì)胞儀檢測(cè)

2 CD4 +CD25 +T 細(xì)胞占外周血CD4 +T 細(xì)胞的比例

在健康人中的比例為4.12% ～7.98%，在哮喘患者中的比例為4.51% ～8.68%，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)見(jiàn)圖2，兩者相比，差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05)。

Figure 2. Ratio of CD4 +CD25 +T of CD4 +T cells detected by flow cytometry.A，B:health group;C，D:asthma group.圖2 外周血CD4 +CD25 +T 占CD4 +T 細(xì)胞比例的流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)

3 鎂(10 mmol/L)對(duì)健康人及哮喘患者外周血CD4 +CD25 +T 細(xì)胞Foxp3 表達(dá)的影響

經(jīng)鎂(10 mmol/L)干預(yù)后，哮喘組CD4+CD25+T 細(xì)胞培養(yǎng)72 h，F(xiàn)oxp3 表達(dá)強(qiáng)度與健康對(duì)照組相比，P ＞0.05，提示鎂(10 mmol/L)對(duì)哮喘組外周血CD4+CD25+T 細(xì)胞的Foxp3 表達(dá)無(wú)影響，見(jiàn)圖3。

Figure 3. Foxp3 expression in CD4 +CD25 + T cells after magnesium treatment detected by flow cytometry.A:evacuation of the debris;B:Foxp3 expression in asthma group;C:Foxp3 expression in health group.圖3 鎂處理后外周血CD4 +CD25 + T 細(xì)胞Foxp3 表達(dá)的流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)

4 鎂(10 mmol/L)對(duì)外周血CD4 +CD25 +T 細(xì)胞凋亡的影響

經(jīng)鎂(10 mmol/L)干預(yù)后，CD4+CD25+T 細(xì)胞培養(yǎng)72 h，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)凋亡率見(jiàn)圖4，健康組與哮喘組分別與陰性對(duì)照組相比，P ＜0.05，提示鎂(10 mmol/L)可以誘導(dǎo)健康人及哮喘患者外周血CD4+CD25+T 細(xì)胞凋亡率增加，見(jiàn)表1，而鎂(10 mmol/L)干預(yù)組的72 h 外周血CD4+CD25+T 細(xì)胞的凋亡率在哮喘組與健康組中沒(méi)有顯著差異(P ＞0.05)。

Figure 4. Apoptosis of CD4 +CD25 + T cells after magnesium treatment detected by flow cytometry.A，B:evacuation of the debris;C:asthma group;D:health group.圖4 鎂處理后外周血CD4 +CD25 + T 淋巴細(xì)胞凋亡的流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)

表1 鎂對(duì)外周血CD4 +CD25 +T 細(xì)胞凋亡率的影響Table 1. Effects of magnesium (10 mmol/L)on apoptotic rate of CD4 +CD25 +T cells (%. ±s.n=12)

表1 鎂對(duì)外周血CD4 +CD25 +T 細(xì)胞凋亡率的影響Table 1. Effects of magnesium (10 mmol/L)on apoptotic rate of CD4 +CD25 +T cells (%. ±s.n=12)

* P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs blank.

Group Asthma Health Magnesium 11.68 ±4.91＊＊ 10.76 ±3.77*Blank 8.07 ±4.90 8.83 ±4.25

討 論

鎂離子(magnesium ion，Mg2+)抑制鈣內(nèi)流，減少細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度，拮抗鈣離子對(duì)支氣管平滑肌的作用，從而使支氣管擴(kuò)張;鎂離子使運(yùn)動(dòng)神經(jīng)末梢乙酰膽堿的釋放量減少，對(duì)抗乙酰膽堿對(duì)平滑肌細(xì)胞的興奮作用，直接舒張平滑肌，改善氣道狹窄，從而改善肺的通氣和換氣功能;臨床實(shí)驗(yàn)證明硫酸鎂還可降低氣道高反應(yīng)性，抑制非特異性炎癥反應(yīng)，預(yù)防及改善哮喘患者的氣道重塑，提高其氣流受限的可逆化程度，從而預(yù)防和緩解哮喘癥狀［1－2］。在本課題組的前期研究中，亦證實(shí)應(yīng)用鎂劑可明顯改善哮喘患者的肺功能［3］，細(xì)胞內(nèi)鎂缺乏的C57BL/6 哮喘小鼠肺組織β2受體表達(dá)減少，在激動(dòng)劑作用下更易發(fā)生β2受體低調(diào)節(jié)［4］。

目前對(duì)支氣管哮喘免疫調(diào)節(jié)方面的研究已成為熱點(diǎn)，近年來(lái)認(rèn)為CD4+T 細(xì)胞除了Th1、Th2 等外還包括多種調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞亞群，均在哮喘患者的免疫調(diào)節(jié)中起重要作用。Treg是指能夠控制或抑制其它細(xì)胞功能的T 細(xì)胞群體，其中CD4+CD25+Treg 最受關(guān)注，是通過(guò)胸腺產(chǎn)生的功能成熟的T細(xì)胞亞群，約占外周血中CD4+T 細(xì)胞的5% ～10%［5］，是Treg 的主要組成部分。目前多個(gè)研究表明，CD4+CD25+Treg的數(shù)量或功能異常有可能導(dǎo)致多種自身免疫性疾病的發(fā)生［6－7］，因此對(duì)CD4+CD25+Treg 的研究有重要意義。然而對(duì)CD4+CD25+Treg 還缺乏足夠的認(rèn)識(shí)，其作用機(jī)制及免疫生物學(xué)特性尚有許多不明之處，如能在體內(nèi)外有效誘導(dǎo)、擴(kuò)增和控制CD4+CD25+Treg 數(shù)量或調(diào)節(jié)其細(xì)胞功能，將會(huì)為支氣管哮喘的治療提供新思路。

本實(shí)驗(yàn)中，CD4+CD25+T 細(xì)胞占外周血CD4+T 細(xì)胞的比例在健康人和哮喘患者中的比例無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，可能與本文選用的哮喘患者部分為非急性發(fā)作患者有關(guān)，但經(jīng)鎂劑處理后，健康組和哮喘組的CD4+CD25+Treg 凋亡均增加，哮喘組的凋亡率高于健康組，但由于哮喘急性發(fā)作者數(shù)量少(只有8 例)，故差異不顯著，但仍然提示適當(dāng)補(bǔ)充鎂劑對(duì)于CD4+CD25+Treg 的凋亡有正調(diào)節(jié)作用，可能對(duì)于哮喘急性發(fā)作患者作用尤為明顯。

近年研究認(rèn)為轉(zhuǎn)錄因子Foxp3 是CD4+CD25+Treg 的一個(gè)相對(duì)特異性標(biāo)記，與其的發(fā)育和功能有關(guān)［8］，F(xiàn)oxp3 作為一特殊的轉(zhuǎn)錄因子特異地高表達(dá)于CD4+CD25+T 細(xì)胞，有研究認(rèn)為其數(shù)量可以反映CD4+CD25+T 細(xì)胞的水平和功能活性［9］。但也有研究認(rèn)為Foxp3 對(duì)于CD4+CD25+Treg 的產(chǎn)生或活化是必需的，但不足以影響其功能，可能還存在其它因素的調(diào)節(jié)［10］。

本實(shí)驗(yàn)中，硫酸鎂可以誘導(dǎo)健康人及哮喘患者外周血CD4+CD25+T 細(xì)胞72 h 的凋亡率增加，但不影響Foxp3 的表達(dá)，表明硫酸鎂調(diào)節(jié)凋亡的作用與機(jī)體的疾病狀態(tài)(哮喘)不相關(guān)，具有廣泛調(diào)節(jié)作用，有可能應(yīng)用于其它免疫相關(guān)疾病，而且與Foxp3 的表達(dá)不相關(guān)。本文進(jìn)行了離體細(xì)胞鎂劑共培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)，但未進(jìn)行鎂劑治療哮喘的人體試驗(yàn)以及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，有待下一步的研究以證實(shí)鎂劑治療哮喘的作用機(jī)制之一為調(diào)節(jié)CD4+CD25+T 細(xì)胞的凋亡。

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