李光偉， 李 波， 康美佳， 徐斐翔， 邢文婧， 徐長(zhǎng)慶，4△

(1齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院病理生理教研室，黑龍江 齊齊哈爾161006;2哈爾濱醫(yī)科大學(xué)病理生理教研室，黑龍江 哈爾濱150086;3齊齊哈爾市第一醫(yī)院胸心外科，黑龍江 齊齊哈爾161006;4黑龍江生物醫(yī)藥工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱150081)

肺動(dòng)脈高壓(pulmonary arterial hypertension，PAH)被稱為“心血管系統(tǒng)的惡性腫瘤”，其臨床癥狀不典型，誤診率高，一旦喪失早期診斷和治療的機(jī)會(huì)，大部分患者將在2 ～3 年內(nèi)死于心力衰竭［1］。慢性阻塞性肺疾病在我國(guó)北方地區(qū)十分常見，最終發(fā)展成肺源性心臟病，嚴(yán)重影響人們的健康和生存質(zhì)量。肺動(dòng)脈高壓是導(dǎo)致肺心病的重要機(jī)制，因此，肺動(dòng)脈高壓和肺心病的早期診斷和有效防治具有重要的臨床意義。但是，肺動(dòng)脈高壓的發(fā)生機(jī)制迄今尚未完全闡明，需要從新的視角加以探討。我們以前的研究證實(shí)，在大鼠肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞中有鈣敏感受體(calcium－sensing receptor，CaSR)的表達(dá)，并且缺氧能夠活化CaSR 導(dǎo)致肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增殖，促進(jìn)肺動(dòng)脈重構(gòu)［2－3］。其具體的機(jī)制如何，CaSR 通過什么信號(hào)途徑引起肺動(dòng)脈重構(gòu)，國(guó)內(nèi)外鮮有報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)將對(duì)上述問題展開研究。

材 料 和 方 法

1 材料

1.1 主要試劑 Cyclin D1、protein kinase B (Akt)、p－AktⅠ抗及Ⅱ抗均購(gòu)自Santa Cruz，細(xì)胞周期試劑盒購(gòu)自Becton Dickinson，BrdU 購(gòu)自Roche Applied Science，Ⅱ型膠原酶購(gòu)自Sigma。

1.2 儀器 Beckman 低溫離心機(jī);立體顯微鏡(Nikon);細(xì)胞缺氧培養(yǎng)箱和酶標(biāo)儀(Thermo)。

2 方法

2.1 肺動(dòng)脈分離和平滑肌細(xì)胞培養(yǎng) 肺動(dòng)脈分離和平滑肌細(xì)胞提取、培養(yǎng)參照文獻(xiàn)［4］。在立體顯微鏡下分離大鼠肺動(dòng)脈，采用Ⅱ型膠原酶消化法提取原代平滑肌細(xì)胞，第3 ～5 代生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

2.2 缺氧模型的復(fù)制及分組 對(duì)照組(control):細(xì)胞去血清培養(yǎng)24 h 后，正常條件培養(yǎng)24 h;缺氧組(H):細(xì)胞去血清培養(yǎng)24 h 后，置于細(xì)胞缺氧培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h(93%N2、2%O2、5%CO2);GdCl3干預(yù)組(H+ Gd):細(xì)胞去血清培養(yǎng)24 h，加入GdCl3(300 μmol/L)后，置于細(xì)胞缺氧培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h;LY294002(PI3K 抑制劑)干預(yù)組(H+LY):細(xì)胞去血清培養(yǎng)24 h，加入LY294002(10 μmol/L)孵育30 min 后加入GdCl3(300 μmol/L)，置于缺氧培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h。

2.3 Western botting 分析cyclin D1、Akt 和p－Akt蛋白的表達(dá) 培養(yǎng)的肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞刮下后加入蛋白裂解液及苯甲基磺酰氟(phenylmethanesul fonyl fluoride，PMSF)，分別在冰上放置40 min，4 ℃下12 000 r/min離心20 min，取上清進(jìn)行蛋白定量。取20 μg 蛋白樣品，10% SDS－PAGE 電泳，100 V 轉(zhuǎn)移1 h 至硝酸纖維素薄膜，封閉1 h;Ⅰ抗分別為anti－cyclin D1 (1∶500)，anti－Akt (1∶500)，anti－p－Akt(1∶500)，anti－GAPDH(1∶500)4 ℃過夜。洗膜后，堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)標(biāo)記的抗IgG 抗體(1∶1 000)孵育1 h，最后用Western blue stabilized substrate for ALP (Promega)顯色，吸光度掃描半定量分析顯影條帶［5－6］。

2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞增殖周期 分別取各組培養(yǎng)的肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞，經(jīng)0.25%胰蛋白酶消化后，用PBS 洗滌2 次，調(diào)整細(xì)胞密度為1 ×106/L，制成單細(xì)胞懸液，2 000 r/min 離心5 min，PBS 洗滌1次2 000 r/min 5 min，加3 mL 預(yù)冷的乙醇固定，4 ℃過夜2 000 r/min 離心5 min，加入緩沖液3 mL 洗滌1 次2 000 r/min 離心5 min，加A 液250 μL，室溫作用10 min，加B 液200 μL，室溫作用10 min，加預(yù)冷的C 液200 μL，室溫避光10 min，上機(jī)檢測(cè)［7］。

2.5 DNA BrdU 摻入法測(cè)定細(xì)胞增殖 細(xì)胞種在96孔板上，密度為3 500 cells/well。細(xì)胞經(jīng)過處理后每孔分別加入BrdU 標(biāo)記的溶液(10 μmol/L)，細(xì)胞固定60 min，然后過氧化物酶標(biāo)記的抗BrdU 抗體(1∶100)室溫孵育90 min，細(xì)胞沖洗3 次，底物溶液室溫孵育5 min，酶標(biāo)儀檢測(cè)［8］。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

1 不同處理因素對(duì)cyclin D1 表達(dá)的影響

缺氧能夠?qū)е耤yclin D1 蛋白表達(dá)增加(P ＜0.05 vs 對(duì)照組);在缺氧基礎(chǔ)上GdCl3能上調(diào)這種增加(P ＜0.05 vs 缺氧組);LY294002 則能夠抑制cyclin D1 的表達(dá)上調(diào)(P ＜0.05 vs 缺氧+GdCl3組)，見圖1。

2 不同處理因素對(duì)細(xì)胞周期及細(xì)胞增殖指數(shù)的影響

與對(duì)照組相比，缺氧組G0/G1期細(xì)胞比例顯著降低，S 和G2/M 期細(xì)胞比例均顯著增加。細(xì)胞增殖指數(shù)(proliferation index)PI = (S +G2/M)/ (S +G2/M+G0/G1)計(jì)算結(jié)果顯示，缺氧狀態(tài)下PI 比對(duì)照組增加了約1.67 倍(P ＜0.05);而缺氧+GdCl3組S 和G2/M 期細(xì)胞比例均明顯增加，PI 值明顯增高，達(dá)到19.83，顯著高于缺氧組(P ＜0.05);LY294002可抑制缺氧誘導(dǎo)的肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增殖，PI 指數(shù)回落到10.3，見圖2。

Figure 1. Protein expression of cyclin D1 in rat PASMCs determined by Western blotting. H:hypoxia group;H +Gd:hypoxia+GdCl3 group;H+Gd+LY:hypoxia+GdCl3 +LY294002 group. ± s. n =3. #P ＜0. 05 vs control group;* P ＜0.05 vs H group;△P ＜0.05 vs H+Gd group.圖1 不同處理因素對(duì)肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞cyclin D1 蛋白表達(dá)的影響

3 不同處理因素對(duì)BrdU 摻入量的影響

以對(duì)照組BrdU 摻入量作為100%，其它實(shí)驗(yàn)組的BrdU 摻入量表示為對(duì)照組的百分?jǐn)?shù)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，缺氧組BrdU 摻入量增加(P ＜0.05);而缺氧+ GdCl3組BrdU 摻入量明顯增加，顯著高于缺氧組(P ＜0.05);LY294002 可抑制缺氧和GdCl3誘導(dǎo)的肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增殖，BrdU摻入量降低(P ＜0.05 vs 缺氧+GdCl3組)，見圖3。

4 不同處理因素對(duì)p－AKT 表達(dá)的影響

Western blotting 檢測(cè)結(jié)果顯示，t－Akt 在各組的表達(dá)沒有顯著性差異;和對(duì)照組比較，缺氧能夠增加p－Akt 蛋白的表達(dá)(P ＜0.05);在此基礎(chǔ)上GdCl3能夠進(jìn)一步增加p－Akt 蛋白的表達(dá)(P ＜0.05 vs 缺氧組);缺氧和GdCl3的這種促進(jìn)效應(yīng)可以被LY294002 抑制(P ＜0.05 vs 缺氧+GdCl3)，見圖4。

討 論

肺動(dòng)脈高壓是一個(gè)多基因和多分子參與的復(fù)雜病理過程，這些因素的相互作用，激活相應(yīng)的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)途徑，最終導(dǎo)致血管重構(gòu)。血管重構(gòu)的主要特征是肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增殖增加或凋亡減少而導(dǎo)致血管中層肥厚［9－10］。我們前期研究結(jié)果顯示，缺氧誘導(dǎo)的CaSR 表達(dá)增加在缺氧性肺動(dòng)脈增殖中發(fā)揮重要的作用，其機(jī)制與CaSR 介導(dǎo)的［Ca2+］i增加有關(guān)，但其具體作用機(jī)制和信號(hào)途徑有待于進(jìn)一步研究［2－3］。

PI3K/Akt 信號(hào)通路是調(diào)節(jié)細(xì)胞功能的重要信號(hào)通路。包括生長(zhǎng)因子在內(nèi)的多種刺激能夠激活血管平滑肌細(xì)胞的PI3K，進(jìn)而提高細(xì)胞內(nèi)IP3含量，然后活化Akt，參與調(diào)控細(xì)胞的遷移、增殖和凋亡等。LY294002 是PI3K 抑制劑，已被廣泛用于PI3K/Akt通路的研究中。

鈣敏感受體是細(xì)胞膜上的G 蛋白耦聯(lián)受體，其激動(dòng)劑分為兩型。I 型激動(dòng)劑(直接激動(dòng))為多價(jià)陽離子，敏感性依次為L(zhǎng)a3+＞Gd3+＞ Be2+＞ Ca2+=Ba2+＞Sr2+＞ Mg2+。它們的強(qiáng)度主要依靠?jī)蓚€(gè)方面:電荷的數(shù)量和陽離子的離子半徑。II 型激動(dòng)劑(通過變構(gòu)效應(yīng)改變受體對(duì)Ca2+的敏感性)多為帶有芳香族側(cè)鏈的氨基酸［11］。本研究選用GdCl3作為鈣敏感受體有效的激動(dòng)劑。

本實(shí)驗(yàn)從對(duì)缺氧肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(pulmonary artery smooth muscle cells，PASMCs)增殖指標(biāo)的評(píng)估中觀察到:在缺氧組，G0/G1期細(xì)胞比例減少，S 和G2/M 期細(xì)胞比例均顯著增加，提示細(xì)胞增殖活躍，由于S 和G2/M 期細(xì)胞比例的增加，PI 相應(yīng)地增加，同時(shí)，缺氧還顯著上調(diào)cyclin D1 表達(dá)水平和BrdU 摻入量，說明缺氧能夠促進(jìn)細(xì)胞增生。鈣敏感受體激動(dòng)劑GdCl3能夠放大缺氧的上述作用。但缺氧加GdCl3促進(jìn)PASMCs 增殖的效應(yīng)卻可以被LY294002所抑制。因此，我們推斷，PI3K/Akt 通路可能參與CaSR 介導(dǎo)的缺氧PASMCs 增殖的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程。

越來越多的文獻(xiàn)報(bào)道，PI3K/Akt 信號(hào)通路在血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cells，VSMCs)增殖的發(fā)生發(fā)展過程中起著非常重要的作用。Duan等［12］發(fā)現(xiàn)胰島素樣生長(zhǎng)因子I(IGF－I)通過PI3K和PKB/Akt 的磷酸化促進(jìn)VSMCs 的增殖和遷移，PI3K 兩種不同類型的抑制藥 Wartmanmin 和LY294002 幾乎都能完全抑制IGF－I 引起的增殖。Hayashi 等［13］報(bào)道，PI3K/Akt 和ERK/p38 MAPK 信號(hào)通路的平衡決定了VSMCs 表型的變化。

本實(shí)驗(yàn)Western blotting 檢測(cè)結(jié)果顯示，和正常對(duì)照組比較，缺氧能夠增加Akt 蛋白的磷酸化;并且GdCl3(CaSR 的激動(dòng)劑)能夠顯著促進(jìn)這種增加;但這種促進(jìn)效應(yīng)可以被LY294002(PI3K/Akt 通路阻斷劑)抑制。該結(jié)果進(jìn)一步支持“PI3K/Akt 通路參與CaSR 激活促進(jìn)缺氧PASMCs 增殖的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程”的推論。

Figure 2. Cell cycle of rat PASMCs determined by flow cytometry. H:hypoxia group;H+Gd:hypoxia+GdCl3 group;H+Gd+LY:hypoxia+GdCl3 +LY294002 group. ±s.n =3. #P ＜0.05 vs control group;* P ＜0.05 vs H group;△P ＜0.05 vs H +Gd group.圖2 不同處理因素對(duì)肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞細(xì)胞周期的影響

Figure 3. The proliferation of rat PASMCs determined by BrdU incorporation assay. H:hypoxia group;H+Gd:hypoxia+GdCl3 group;H+Gd+LY:hypoxia+GdCl3 +LY294002 group.±s.n=3. #P ＜0.05 vs control group;* P ＜0.05 vs H group;△P ＜0.05 vs H+Gd group.圖3 不同處理因素對(duì)肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞BrdU 摻入率的影響

Figure 4. Protein expression of p－Akt in rat PASMCs determined by Western blotting. H:hypoxia group;H +Gd:hypoxia+GdCl3 group;H+Gd+LY:hypoxia+GdCl3 +LY294002 group. ± s. n =3. #P ＜0.05 vs control group;* P ＜0.05 vs H group;△P ＜0.05 vs H+Gd group.圖4 不同處理因素對(duì)肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞Akt 磷酸化的影響

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